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時(shí)間：2024-02-21 14:39:58
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基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在?；蚨鄳B(tài)性可通過藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來影響物的作用。
基因多態(tài)性對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面。與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多?；蚨鄳B(tài)性對(duì)藥效動(dòng)力學(xué)的影響主要是受體蛋白編碼基因的多態(tài)性使個(gè)體對(duì)藥物敏感性發(fā)生差異。
苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性：咪唑安定由CYP3A代謝，不同個(gè)體對(duì)咪唑安定的清除率可有五倍的差異。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代謝，基因的差異在臨床上可表現(xiàn)為用藥后鎮(zhèn)靜時(shí)間的延長(zhǎng)。
吸入與基因多態(tài)性：RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)。
神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性：丁酰膽堿酯酶是水解琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，與用藥后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。
鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性：μ-阿片受體是阿片類藥的主要作用部位，常見的基因多態(tài)性是A118G和G2172T?？纱蚝颓R多通過CYP2D6代謝。此外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。
局部與基因多態(tài)性：羅哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代謝。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A，可能影響藥物代謝速度。
一直以來麻醉科醫(yī)生較其它專業(yè)的醫(yī)療人員更能意識(shí)到不同個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)存在差異。的藥物基因組學(xué)研究將不僅更加合理的解釋藥效與不良反應(yīng)的個(gè)體差異，更重要的是在用藥前就可以根據(jù)病人的遺傳特征選擇最有效而副作用最小的藥物種類和劑型，達(dá)到真正的個(gè)體化用藥。
能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病人對(duì)麻醉及鎮(zhèn)痛藥物的反應(yīng)，一直是廣大麻醉科醫(yī)生追求的目標(biāo)之一。若能了解藥物基因組學(xué)的基本原理，掌握用藥的個(gè)體化原則，就有可能根據(jù)病人的不同基因組學(xué)特性合理用藥，達(dá)到提高藥效，降低毒性，防止不良反應(yīng)的目的。本文對(duì)藥物基因組學(xué)的基本概念和常用的藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
一、概述
二十世紀(jì)60年代對(duì)臨床麻醉過程中應(yīng)用琥珀酰膽堿后長(zhǎng)時(shí)間窒息、硫噴妥鈉誘發(fā)卟啉癥及惡性高熱等的研究促進(jìn)了藥物遺傳學(xué)（Pharmacogenetics）的形成和發(fā)展,可以說這門學(xué)科最早的研究就是從麻醉學(xué)開始的。
藥物基因組學(xué)(Phamacogenomics)是伴隨人類基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展而開辟的藥物遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，主要闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性及藥物作用包括療效和毒副作用之間的關(guān)系。它是以提高藥物的療效及安全性為目標(biāo)，研究影響藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、消除等個(gè)體差異的基因特性，以及基因變異所致的不同病人對(duì)藥物的不同反應(yīng)，并由此開發(fā)新的藥物和用藥方法的科學(xué)。
1959年Vogel提出了“藥物遺傳學(xué)”,1997年Marshall提出“藥物基因組學(xué)”。藥物基因組學(xué)是藥物遺傳學(xué)的延伸和發(fā)展，兩者的研究方法和范疇有頗多相似之處，都是研究基因的遺傳變異與藥物反應(yīng)關(guān)系的學(xué)科。但藥物遺傳學(xué)主要集中于研究單基因變異，特別是藥物代謝酶基因變異對(duì)藥物作用的影響；而藥物基因組學(xué)除覆蓋藥物遺傳學(xué)研究范疇外，還包括與藥物反應(yīng)有關(guān)的所有遺傳學(xué)標(biāo)志，藥物代謝靶受體或疾病發(fā)生鏈上諸多環(huán)節(jié)，所以研究領(lǐng)域更為廣泛[1,2,3]。
二、基本概念
1．分子生物學(xué)基本概念
基因是一個(gè)遺傳密碼單位，由位于一條染色體(即一條長(zhǎng)DNA分子和與其相關(guān)的蛋白)上特定位置的一段DNA序列組成。等位基因是位于染色體單一基因座位上的、兩種或兩種以上不同形式基因中的一種。人類基因或等位基因變異最常見的類型是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前為止，已經(jīng)鑒定出13000000多種SNPs。突變和多態(tài)性常可互換使用，但一般來說，突變是指低于1%的群體發(fā)生的變異，而多態(tài)性是高于1%的群體發(fā)生的變異。
2．基因多態(tài)性的命名法：
(1)數(shù)字前面的字母代表該基因座上最常見的核苷酸(即野生型)，而數(shù)字后的字母則代表突變的核苷酸。例如：μ阿片受體基因A118G指的是在118堿基對(duì)上的腺嘌呤核苷酸(A)被鳥嘌呤核苷酸(G)取代，也可寫成118A/G或118A>G。
(2)對(duì)于單個(gè)基因密碼子導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換的多態(tài)性編碼也可以用相互轉(zhuǎn)換的氨基酸的來標(biāo)記。例如：丁酰膽堿酯酶基因多態(tài)性Asp70Gly是指此蛋白質(zhì)中第70個(gè)氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。
三、藥物基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容
基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道及基因本身作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。這些基因編碼蛋白大致可分為三大類:藥物代謝酶、藥物作用靶點(diǎn)、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中研究最為深入的是物與藥物代謝酶CYP45O酶系基因多態(tài)性的相關(guān)性[1,2,3]。
基因多態(tài)性可通過藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來影響藥物作用，對(duì)于臨床較常用的、治療劑量范圍較窄的、替代藥物較少的物尤其需引起臨床重視。
（一）基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響
基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)
的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面[3,4,5,6]。
1、藥物代謝酶
與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。
（1）細(xì)胞色素P-450（CYP45O）
物絕大部分在肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，參與反應(yīng)的主要酶類是由一個(gè)龐大基因家族編碼控制的細(xì)胞色素P450的氧化酶系統(tǒng)，其主要成分是細(xì)胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O組成復(fù)雜，受基因多態(tài)性影響，稱為CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反應(yīng)CYP45O基因超家族內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系的統(tǒng)一命名法：凡CYP45O基因表達(dá)的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的視為同一家族（Family），以CYP后標(biāo)阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%為同一亞族（Subfamily），在家族表達(dá)后面加一大寫字母，如CYP2D；每一亞族中的單個(gè)變化則在表達(dá)式后加上一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字，如CYP2D6。
（2）丁酰膽堿酯酶
麻醉過程中常用短效肌松劑美維庫(kù)銨和琥珀酰膽堿，其作用時(shí)限依賴于水解速度。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是水解這兩種藥物的酶，它的基因變異會(huì)使肌肉麻痹持續(xù)時(shí)間在個(gè)體間出現(xiàn)顯著差異。
2、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多態(tài)性
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制藥物的攝取、分布和排除。P-糖蛋白參與很多藥物的能量依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括一些止吐藥、鎮(zhèn)痛藥和抗心律失常藥等。P-糖蛋白由多藥耐藥基因（MDR1）編碼。不同個(gè)體間P-糖蛋白的表達(dá)差別明顯，MDR1基因的數(shù)種SNPs已經(jīng)被證實(shí)，但其對(duì)臨床麻醉的意義還不清楚。
（二）基因多態(tài)性對(duì)藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響
物的受體（藥物靶點(diǎn)）蛋白編碼基因的多態(tài)性有可能引起個(gè)體對(duì)許多藥物敏感性的差異，產(chǎn)生不同的藥物效應(yīng)和毒性反應(yīng)[7,8]。
1、藍(lán)尼定受體-1（Ryanodinereceptor-1，RYR1）
藍(lán)尼定受體-1是一種骨骼肌的鈣離子通道蛋白，參與骨骼肌的收縮過程。惡性高熱（malignanthyperthermia,MH）是一種具有家族遺傳性的、由于RYR1基因異常而導(dǎo)致RYR1存在缺陷的亞臨床肌肉病，在揮發(fā)性吸入和琥珀酰膽堿的觸發(fā)下可以出現(xiàn)骨骼肌異常高代謝狀態(tài)，以至導(dǎo)致患者死亡。
2、阿片受體
μ-阿片受體由OPRM1基因編碼，是臨床使用的大部分阿片類藥物的主要作用位點(diǎn)。OPRM1基因的多態(tài)性在啟動(dòng)子、內(nèi)含子和編碼區(qū)均有發(fā)生，可引起受體蛋白的改變。嗎啡和其它阿片類藥物與μ-受體結(jié)合而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及呼吸抑制。不同個(gè)體之間μ-阿片受體基因的表達(dá)水平有差異，對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)也有差異，對(duì)阿片藥物的反應(yīng)也不同。
3、GABAA和NMDA受體
γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體是遞質(zhì)門控離子通道，能夠調(diào)節(jié)多種物的效應(yīng)。GABAA受體的亞單位（α、β、γ、δ、ε和θ）的編碼基因存在多態(tài)性（尤其α和β），可能與孤獨(dú)癥、酒精依賴、癲癇及精神分裂癥有關(guān)，但尚未見與物敏感性有關(guān)的報(bào)道。N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體的多態(tài)性也有報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的疾病。
（三）基因多態(tài)性對(duì)其它調(diào)節(jié)因子的影響
有些蛋白既不是藥物作用的直接靶點(diǎn)，也不影響藥代和藥效動(dòng)力學(xué)，但其編碼基因的多態(tài)性在某些特定情況下會(huì)改變個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)。例如，載脂蛋白E基因的遺傳多態(tài)性可以影響羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）的治療反應(yīng)。鮮紅色頭發(fā)的出現(xiàn)幾乎都是黑皮質(zhì)素-1受體（MC1R）基因突變的結(jié)果。MC1R基因敲除的老鼠對(duì)的需求量增加。先天紅發(fā)婦女對(duì)地氟醚的需要量增加，熱痛敏上升而局麻效力減弱。
四、苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性
大多數(shù)苯二氮卓類藥經(jīng)肝臟CYP45O代謝形成極性代謝物，由膽汁或尿液排出。常用的苯二氮卓類藥物咪唑安定就是由CYP3A代謝，其代謝產(chǎn)物主要是1-羥基咪唑安定，其次是4-羥基咪唑安定。在體實(shí)驗(yàn)顯示不同個(gè)體咪唑安定的清除率可有五倍的差異。
地西泮是另一種常用的苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥，由CYP2C19和CYP2D6代謝。細(xì)胞色素CYP2C19的G681A多態(tài)性中A等位基因純合子個(gè)體與正常等位基因G純合子個(gè)體相比，地西泮的半衰期延長(zhǎng)4倍，可能是CYP2C19的代謝活性明顯降低的原因。A等位基因雜合子個(gè)體對(duì)地西泮代謝的半衰期介于兩者之間。這些基因的差異在臨床上表現(xiàn)為地西泮用藥后鎮(zhèn)靜或意識(shí)消失的時(shí)間延長(zhǎng)[9,10]。
五、吸入與基因多態(tài)性
到目前為止，吸入的藥物基因組學(xué)研究主要集中于尋找引起藥物副反應(yīng)的遺傳方面的原因，其中研究最多的是MH。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。
與MH不同，氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)，但其發(fā)生機(jī)制還不十分清楚[7,11]。
六、神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性
神經(jīng)肌肉阻滯藥如琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的作用與遺傳因素密切相關(guān)。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是一種水解這兩種藥物的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，其第70位發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的改變，與應(yīng)用肌松劑后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。如果丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性雜合子(單個(gè)等位基因)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致膽堿酯酶活性降低，藥物作用時(shí)間通常會(huì)延長(zhǎng)3～8倍；而丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性的純合子(2個(gè)等位基因)表達(dá)則更加延長(zhǎng)其恢復(fù)時(shí)間，比正常人增加60倍。法國(guó)的一項(xiàng)研究表明，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，16例發(fā)生過窒息延長(zhǎng)的病人中13例被檢測(cè)為A變異體陽(yáng)性。預(yù)先了解丁酰膽堿酯酶基因型的改變，避免這些藥物的應(yīng)用可以縮短術(shù)后恢復(fù)時(shí)間和降低醫(yī)療費(fèi)用[6,12]。
七、鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性
μ-阿片受體是臨床應(yīng)用的阿片類藥的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在兩種常見μ-阿片受體基因變異，即A118G和G2172T。A118G變異型使阿片藥物的鎮(zhèn)痛效力減弱。另一種阿片相關(guān)效應(yīng)—瞳孔縮小，在118G攜帶者明顯減弱。多態(tài)性還可影響阿片類藥物
的代謝。
阿片類藥物的重要的代謝酶是CYP2D6?？纱蛲ㄟ^CYP2D6轉(zhuǎn)化為它的活性代謝產(chǎn)物－嗎啡，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。對(duì)33名曾使用過曲馬多的死者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，CYP2D6等位基因表達(dá)的數(shù)量與曲馬多和O－和N－去甲基曲馬多的血漿濃度比值密切相關(guān)，說明其代謝速度受CYP2D6多態(tài)性的影響。除CYP2D6外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。已證實(shí)CYP3A4在其它阿片類藥如芬太尼、阿芬太尼和蘇芬太尼的代謝方面也發(fā)揮重要作用。
有報(bào)道顯示兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。COMT是兒茶酚胺代謝的重要介質(zhì)，也是痛覺傳導(dǎo)通路上腎上腺素能和多巴胺能神經(jīng)的調(diào)控因子。研究證實(shí)Val158MetCOMT基因多態(tài)性可以使該酶的活性下降3～4倍。Zubieta等報(bào)道，G1947A多態(tài)性個(gè)體對(duì)實(shí)驗(yàn)性疼痛的耐受性較差，μ-阿片受體密度增加，內(nèi)源性腦啡肽水平降低[13～16]。
八、局部與基因多態(tài)性
羅哌卡因是一種新型的酰胺類局麻藥，有特有的S-(-)-S對(duì)應(yīng)體，主要經(jīng)肝臟代謝消除。羅哌卡因代謝產(chǎn)物3-OH-羅哌卡因由CYP1A2代謝生成，而4-OH-羅哌卡因、2-OH-羅哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)則主要由CYP3A4代謝生成。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A。Mendoza等對(duì)159例墨西哥人的DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因的突變率為43%。Murayama等發(fā)現(xiàn)日本人中CYP1A2基因存在6種導(dǎo)致氨基酸替換的SNPs。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究、個(gè)體化用藥具有重要意義[17,18,19]。
基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在?；蚨鄳B(tài)性可通過藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來影響麻醉藥物的作用。
基因多態(tài)性對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面。與麻醉藥物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多?；蚨鄳B(tài)性對(duì)藥效動(dòng)力學(xué)的影響主要是受體蛋白編碼基因的多態(tài)性使個(gè)體對(duì)藥物敏感性發(fā)生差異。
苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性：咪唑安定由CYP3A代謝，不同個(gè)體對(duì)咪唑安定的清除率可有五倍的差異。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代謝，基因的差異在臨床上可表現(xiàn)為用藥后鎮(zhèn)靜時(shí)間的延長(zhǎng)。
吸入麻醉藥與基因多態(tài)性：RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)。
神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性：丁酰膽堿酯酶是水解琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，與用藥后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。
鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性：μ-阿片受體是阿片類藥的主要作用部位，常見的基因多態(tài)性是A118G和G2172T?？纱蚝颓R多通過CYP2D6代謝。此外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。
局部麻醉藥與基因多態(tài)性：羅哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代謝。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A，可能影響藥物代謝速度。
一直以來麻醉科醫(yī)生較其它專業(yè)的醫(yī)療人員更能意識(shí)到不同個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)存在差異。麻醉藥的藥物基因組學(xué)研究將不僅更加合理的解釋藥效與不良反應(yīng)的個(gè)體差異，更重要的是在用藥前就可以根據(jù)病人的遺傳特征選擇最有效而副作用最小的藥物種類和劑型，達(dá)到真正的個(gè)體化用藥。
能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病人對(duì)麻醉及鎮(zhèn)痛藥物的反應(yīng)，一直是廣大麻醉科醫(yī)生追求的目標(biāo)之一。若能了解藥物基因組學(xué)的基本原理，掌握用藥的個(gè)體化原則，就有可能根據(jù)病人的不同基因組學(xué)特性合理用藥，達(dá)到提高藥效，降低毒性，防止不良反應(yīng)的目的。本文對(duì)藥物基因組學(xué)的基本概念和常用麻醉藥的藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
一、 概述
二十世紀(jì)60年代對(duì)臨床麻醉過程中應(yīng)用琥珀酰膽堿后長(zhǎng)時(shí)間窒息、硫噴妥鈉誘發(fā)卟啉癥及惡性高熱等的研究促進(jìn)了藥物遺傳學(xué)（Pharmacogenetics）的形成和發(fā)展，可以說這門學(xué)科最早的研究就是從麻醉學(xué)開始的。
藥物基因組學(xué)(Phamacogenomics)是伴隨人類基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展而開辟的藥物遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，主要闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性及藥物作用包括療效和毒副作用之間的關(guān)系。它是以提高藥物的療效及安全性為目標(biāo)，研究影響藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、消除等個(gè)體差異的基因特性，以及基因變異所致的不同病人對(duì)藥物的不同反應(yīng)，并由此開發(fā)新的藥物和用藥方法的科學(xué)。
1959年Vogel提出了“藥物遺傳學(xué)”，1997年Marshall提出“藥物基因組學(xué)”。藥物基因組學(xué)是藥物遺傳學(xué)的延伸和發(fā)展，兩者的研究方法和范疇有頗多相似之處，都是研究基因的遺傳變異與藥物反應(yīng)關(guān)系的學(xué)科。但藥物遺傳學(xué)主要集中于研究單基因變異，特別是藥物代謝酶基因變異對(duì)藥物作用的影響；而藥物基因組學(xué)除覆蓋藥物遺傳學(xué)研究范疇外，還包括與藥物反應(yīng)有關(guān)的所有遺傳學(xué)標(biāo)志，藥物代謝靶受體或疾病發(fā)生鏈上諸多環(huán)節(jié)，所以研究領(lǐng)域更為廣泛[1，2，3]。
二、基本概念
1．分子生物學(xué)基本概念
基因是一個(gè)遺傳密碼單位，由位于一條染色體(即一條長(zhǎng)DNA分子和與其相關(guān)的蛋白)上特定位置的一段DNA序列組成。等位基因是位于染色體單一基因座位上的、兩種或兩種以上不同形式基因中的一種。人類基因或等位基因變異最常見的類型是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。目前為止，已經(jīng)鑒定出13 000 000多種SNPs。突變和多態(tài)性?？苫Q使用，但一般來說，突變是指低于1%的群體發(fā)生的變異，而多態(tài)性是高于1%的群體發(fā)生的變異。
2．基因多態(tài)性的命名法：
(1)數(shù)字前面的字母代表該基因座上最常見的核苷酸(即野生型)，而數(shù)字后的字母則代表突變的核苷酸。例如：μ阿片受體基因A118G指的是在118堿基對(duì)上的腺嘌呤核苷酸(A)被鳥嘌呤核苷酸(G)取代，也可寫成118A/G或118A>G。
(2)對(duì)于單個(gè)基因密碼子導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換的多態(tài)性編碼也可以用相互轉(zhuǎn)換的氨基酸的來標(biāo)記。例如：丁酰膽堿酯酶基因多態(tài)性Asp70Gly是指此蛋白質(zhì)中第70個(gè)氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。
三、藥物基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容
基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道及基因本身作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。這些基因編碼蛋白大致可分為三大類:藥物代謝酶、藥物作用靶點(diǎn)、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中研究最為深入的是麻醉藥物與藥物代謝酶CYP45O酶系基因多態(tài)性的相關(guān)性[1，2，3]。
基因多態(tài)性可通過藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來影響藥物作用，對(duì)于臨床較常用的、治療劑量范圍較窄的、替代藥物較少的麻醉藥物尤其需引起臨床重視。
（一）基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響
基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面[3，4，5，6]。
1、藥物代謝酶
與麻醉藥物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。
（1）細(xì)胞色素P-450（CYP45O）
麻醉藥物絕大部分在肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，參與反應(yīng)的主要酶類是由一個(gè)龐大基因家族編碼控制的細(xì)胞色素P450的氧化酶系統(tǒng)，其主要成分是細(xì)胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O組成復(fù)雜，受基因多態(tài)性影響，稱為CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反應(yīng)CYP45O基因超家族內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系的統(tǒng)一命名法：凡CYP45O基因表達(dá)的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的視為同一家族（Family），以CYP后標(biāo)阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%為同一亞族（Subfamily），在家族表達(dá)后面加一大寫字母，如CYP2D；每一亞族中的單個(gè)變化則在表達(dá)式后加上一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字，如CYP2D6。
（2）丁酰膽堿酯酶
麻醉過程中常用短效肌松劑美維庫(kù)銨和琥珀酰膽堿，其作用時(shí)限依賴于水解速度。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是水解這兩種藥物的酶，它的基因變異會(huì)使肌肉麻痹持續(xù)時(shí)間在個(gè)體間出現(xiàn)顯著差異。
2、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多態(tài)性
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制藥物的攝取、分布和排除。P-糖蛋白參與很多藥物的能量依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括一些止吐藥、鎮(zhèn)痛藥和抗心律失常藥等。P-糖蛋白由多藥耐藥基因（MDR1）編碼。不同個(gè)體間P-糖蛋白的表達(dá)差別明顯，MDR1基因的數(shù)種SNPs已經(jīng)被證實(shí)，但其對(duì)臨床麻醉的意義還不清楚。
（二）基因多態(tài)性對(duì)藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響
麻醉藥物的受體（藥物靶點(diǎn)）蛋白編碼基因的多態(tài)性有可能引起個(gè)體對(duì)許多藥物敏感性的差異，產(chǎn)生不同的藥物效應(yīng)和毒性反應(yīng)[7，8]。
1、藍(lán)尼定受體-1（Ryanodine receptor-1，RYR1）
藍(lán)尼定受體-1是一種骨骼肌的鈣離子通道蛋白，參與骨骼肌的收縮過程。惡性高熱（malignant hyperthermia，MH）是一種具有家族遺傳性的、由于RYR1 基因異常而導(dǎo)致RYR1存在缺陷的亞臨床肌肉病，在揮發(fā)性吸入麻醉藥和琥珀酰膽堿的觸發(fā)下可以出現(xiàn)骨骼肌異常高代謝狀態(tài)，以至導(dǎo)致患者死亡。
2、阿片受體
μ-阿片受體由OPRM1基因編碼，是臨床使用的大部分阿片類藥物的主要作用位點(diǎn)。OPRM1基因的多態(tài)性在啟動(dòng)子、內(nèi)含子和編碼區(qū)均有發(fā)生，可引起受體蛋白的改變。嗎啡和其它阿片類藥物與μ-受體結(jié)合而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及呼吸抑制。不同個(gè)體之間μ-阿片受體基因的表達(dá)水平有差異，對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)也有差異，對(duì)阿片藥物的反應(yīng)也不同。
3、GABAA 和 NMDA受體
γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體是遞質(zhì)門控離子通道，能夠調(diào)節(jié)多種麻醉藥物的效應(yīng)。GABAA受體的亞單位（α、β、γ、δ、ε和θ）的編碼基因存在多態(tài)性（尤其α和β），可能與孤獨(dú)癥、酒精依賴、癲癇及精神分裂癥有關(guān)，但尚未見與麻醉藥物敏感性有關(guān)的報(bào)道。N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體的多態(tài)性也有報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的疾病。
（三）基因多態(tài)性對(duì)其它調(diào)節(jié)因子的影響
有些蛋白既不是藥物作用的直接靶點(diǎn)，也不影響藥代和藥效動(dòng)力學(xué)，但其編碼基因的多態(tài)性在某些特定情況下會(huì)改變個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)。例如，載脂蛋白E基因的遺傳多態(tài)性可以影響羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）的治療反應(yīng)。鮮紅色頭發(fā)的出現(xiàn)幾乎都是黑皮質(zhì)素-1受體（MC1R）基因突變的結(jié)果。MC1R基因敲除的老鼠對(duì)麻醉藥的需求量增加。先天紅發(fā)婦女對(duì)地氟醚的需要量增加，熱痛敏上升而局麻效力減弱。
四、苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性
大多數(shù)苯二氮卓類藥經(jīng)肝臟CYP45O代謝形成極性代謝物，由膽汁或尿液排出。常用的苯二氮卓類藥物咪唑安定就是由CYP3A代謝，其代謝產(chǎn)物主要是1-羥基咪唑安定，其次是4-羥基咪唑安定。在體實(shí)驗(yàn)顯示不同個(gè)體咪唑安定的清除率可有五倍的差異。
地西泮是另一種常用的苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥，由CYP2C19和CYP2D6代謝。細(xì)胞色素CYP 2C19的G681A多態(tài)性中A等位基因純合子個(gè)體與正常等位基因G純合子個(gè)體相比，地西泮的半衰期延長(zhǎng)4倍，可能是CYP2C19的代謝活性明顯降低的原因。A等位基因雜合子個(gè)體對(duì)地西泮代謝的半衰期介于兩者之間。這些基因的差異在臨床上表現(xiàn)為地西泮用藥后鎮(zhèn)靜或意識(shí)消失的時(shí)間延長(zhǎng)[9，10]。
五、吸入麻醉藥與基因多態(tài)性
到目前為止，吸入麻醉藥的藥物基因組學(xué)研究主要集中于尋找引起藥物副反應(yīng)的遺傳方面的原因，其中研究最多的是MH。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。
與MH不同，氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)，但其發(fā)生機(jī)制還不十分清楚 [7，11]。
六、神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性
神經(jīng)肌肉阻滯藥如琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的作用與遺傳因素密切相關(guān)。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是一種水解這兩種藥物的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，其第70位發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的改變，與應(yīng)用肌松劑后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。如果丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性雜合子(單個(gè)等位基因)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致膽堿酯酶活性降低，藥物作用時(shí)間通常會(huì)延長(zhǎng)3～8倍；而丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性的純合子(2個(gè)等位基因)表達(dá)則更加延長(zhǎng)其恢復(fù)時(shí)間，比正常人增加60倍。法國(guó)的一項(xiàng)研究表明，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，16例發(fā)生過窒息延長(zhǎng)的病人中13例被檢測(cè)為A變異體陽(yáng)性。預(yù)先了解丁酰膽堿酯酶基因型的改變，避免這些藥物的應(yīng)用可以縮短術(shù)后恢復(fù)時(shí)間和降低醫(yī)療費(fèi)用[6，12]。
七、鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性
μ-阿片受體是臨床應(yīng)用的阿片類藥的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在兩種常見μ-阿片受體基因變異，即A118G和G2172T。A118G變異型使阿片藥物的鎮(zhèn)痛效力減弱。另一種阿片相關(guān)效應(yīng)—瞳孔縮小，在118G攜帶者明顯減弱。多態(tài)性還可影響阿片類藥物的代謝。
阿片類藥物的重要的代謝酶是CYP2D6。可待因通過CYP2D6轉(zhuǎn)化為它的活性代謝產(chǎn)物－嗎啡，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。對(duì)33名曾使用過曲馬多的死者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，CYP2D6等位基因表達(dá)的數(shù)量與曲馬多和O－和N－去甲基曲馬多的血漿濃度比值密切相關(guān)，說明其代謝速度受CYP2D6多態(tài)性的影響。除CYP2D6外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。已證實(shí)CYP3A4在其它阿片類藥如芬太尼、阿芬太尼和蘇芬太尼的代謝方面也發(fā)揮重要作用。
有報(bào)道顯示兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。COMT是兒茶酚胺代謝的重要介質(zhì)，也是痛覺傳導(dǎo)通路上腎上腺素能和多巴胺能神經(jīng)的調(diào)控因子。研究證實(shí)Val158Met COMT基因多態(tài)性可以使該酶的活性下降3～4倍。Zubieta等報(bào)道，G1947A多態(tài)性個(gè)體對(duì)實(shí)驗(yàn)性疼痛的耐受性較差，μ-阿片受體密度增加，內(nèi)源性腦啡肽水平降低[13～16]。
八、局部麻醉藥與基因多態(tài)性
羅哌卡因是一種新型的酰胺類局麻藥，有特有的S-(-)-S對(duì)應(yīng)體，主要經(jīng)肝臟代謝消除。羅哌卡因代謝產(chǎn)物3-OH-羅哌卡因由CYP1A2代謝生成，而4-OH-羅哌卡因、2-OH-羅哌卡因和2-6-pipecoloxylidide (PPX)則主要由CYP3A4代謝生成。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A。Mendoza等對(duì)159例墨西哥人的DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因的突變率為43%。Murayama等發(fā)現(xiàn)日本人中CYP1A2基因存在6種導(dǎo)致氨基酸替換的SNPs。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究、個(gè)體化用藥具有重要意義[17，18，19]。
2教學(xué)手段與方法的改良
傳統(tǒng)的基因工程教學(xué)方法在水產(chǎn)類高等學(xué)校中多以板書結(jié)合多媒體的方法來講解概念、原理以及性質(zhì)等內(nèi)容，其過程相對(duì)機(jī)械、枯燥，使得學(xué)生難以理解所學(xué)內(nèi)容。對(duì)此，筆者通過多媒體教學(xué)與自制模型演示相結(jié)合的方法取代原有的傳統(tǒng)教學(xué)。由于基因工程的很多內(nèi)容相對(duì)抽象，僅僅通過文字、圖片和語(yǔ)言來表述是難以講解透徹的。現(xiàn)代的多媒體教學(xué)技術(shù)具有圖文聲像隨意組合、靈活多變的特點(diǎn)，為學(xué)生創(chuàng)造了良好的學(xué)習(xí)情境。通過功能強(qiáng)大的各種計(jì)算機(jī)軟件把一些很難理解的內(nèi)容做成動(dòng)畫影片，化難為易、化靜為動(dòng)、變抽象為形象，使學(xué)生對(duì)上課產(chǎn)生興趣，促進(jìn)學(xué)生對(duì)知識(shí)學(xué)習(xí)的渴望。同時(shí)，利用自制的模型講解課程中的重點(diǎn)以及難點(diǎn)。例如:在介紹限制酶的切割位點(diǎn)時(shí)，讓學(xué)生手持模型，分別角色扮演限制酶和基因序列，在排列位置的互換中了解3種切口的方式以及位置。這樣的教學(xué)方法不僅形象，也讓學(xué)生在互動(dòng)中快速、深刻地記憶知識(shí)要點(diǎn)。另外，通過當(dāng)下研究的前沿話題為例，先提出一個(gè)問題，引導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用其他課程所學(xué)過的或者自身所積累的知識(shí)來聯(lián)想、分析、討論，自己設(shè)計(jì)解答此問題的方法或?qū)嶒?yàn)流程。然后老師再參與其中，在討論和修改方法以及實(shí)驗(yàn)流程的過程中，引出所要講授的新的概念和知識(shí)要點(diǎn)。
例如介紹表達(dá)物質(zhì)(蛋白質(zhì))的鑒定時(shí)，老師會(huì)先提出問題:基因克隆表達(dá)出的物質(zhì)是什么?這些物質(zhì)是由什么組成的?鑒定這些物質(zhì)可以使用什么方法?然后引導(dǎo)學(xué)生回顧生物學(xué)中心法則，得出基因表達(dá)物質(zhì)為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是由氨基酸組成等所學(xué)過的知識(shí)，由此學(xué)生可歸納出氨基酸測(cè)序法等鑒定蛋白質(zhì)的方法。最后老師再在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充出WesternBlot法、生物質(zhì)譜技術(shù)等新的鑒定方法。這樣的講課方式讓學(xué)生回到課堂上的主角位置，在復(fù)習(xí)了以往的知識(shí)要點(diǎn)的同時(shí)也加深了學(xué)生對(duì)新知識(shí)的理解與記憶，在一定程度上啟發(fā)了學(xué)生如何去發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。此外，基因工程是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的課程，在講授理論課的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)課的安排也是非常重要的。設(shè)計(jì)好與理論課相配套的實(shí)驗(yàn)課程，可以使學(xué)生加深對(duì)基因工程學(xué)理論的學(xué)習(xí)和理解，達(dá)到理論和實(shí)踐相結(jié)合的目的。對(duì)此，各大高校均在基因工程實(shí)驗(yàn)課上進(jìn)行了改革創(chuàng)新，但有一點(diǎn)總被忽略，那就是實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)高?；蚬こ虒?shí)驗(yàn)課所使用的研究對(duì)象均為果蠅等無脊椎模式生物。這種情況對(duì)于普通高校而言是可行的，但是對(duì)于擁有特色學(xué)科的水產(chǎn)類高校而言，研究對(duì)象也應(yīng)具有其專業(yè)特點(diǎn)。所以本實(shí)驗(yàn)課所使用的研究對(duì)象是斑馬魚這種海洋模式生物。研究對(duì)象的改變雖微不足道，但是能讓學(xué)生更好地理解自己所學(xué)專業(yè)的特色，在實(shí)踐操作中加深對(duì)所屬專業(yè)的熱愛。
3成績(jī)考核
中國(guó)傳統(tǒng)的應(yīng)試教育產(chǎn)生了“高分決定一切”的迂腐思想。隨著國(guó)家教育體系改革的不斷推進(jìn)，學(xué)生對(duì)于專業(yè)知識(shí)的掌握與否，已經(jīng)不能僅從一張考卷成績(jī)的高低來反映，考核成績(jī)的結(jié)構(gòu)應(yīng)向多元化的方向發(fā)展?；蚬こ痰淖罱K考核成績(jī)主要包括兩部分:平時(shí)成績(jī)占40%，其中課堂出勤率10%、課堂討論10%、課堂小考10%以及實(shí)驗(yàn)報(bào)告10%;期末考試成績(jī)占60%。這樣的考核體系改變了過去注重結(jié)果忽略過程的做法，讓學(xué)生在平時(shí)將知識(shí)一點(diǎn)一滴地積累起來。同時(shí)，也讓授課教師能夠及時(shí)得到教學(xué)效果的反饋信息，進(jìn)一步提高教學(xué)水平。
abstractthe discovery of small rna was expounded,the characteristics,function and mechanism of action were introduced,and the prospect of the research was made for the small rna study.
key wordssmall rna小rna是一類新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度為21~25個(gè)核苷酸的小分子rna,它普遍存在于多細(xì)胞生物中,占整個(gè)基因組基因總數(shù)的2%左右。小rna是最為重要的調(diào)控rna分子,它可直接調(diào)控某些基因的開關(guān),從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,并決定細(xì)胞分化的組織類型。根據(jù)小rna的生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為3類:小干涉rna(small interfering rna,sirna)、微rna(micrornas,mirnas)和其他小rna。小rna在生物進(jìn)化過程中高度保守,并已被證實(shí)參與和調(diào)控包括時(shí)序發(fā)育、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元發(fā)育、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程[1]。小rna自1998年被發(fā)現(xiàn)以來,至今已有飛速的發(fā)展,目前在種類、特征、分子機(jī)制等方面的研究都有了突破性的進(jìn)展,研究前景十分廣闊。
1小rna的發(fā)現(xiàn)
1998年,生物學(xué)家發(fā)現(xiàn),在果蠅和其他真核生物中導(dǎo)入外源雙鏈rna分子,可以使內(nèi)源基因相應(yīng)序列基因的mrna降解,從而引發(fā)同源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默,這種基因表達(dá)的抑制作用稱為rna干擾。小干涉rna在rna干擾途徑的中間產(chǎn)生,最終可導(dǎo)致靶mrna降解產(chǎn)生rna干擾作用[2]。
mirnas是sirna(small interfering rna)之后發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mrna穩(wěn)定的rna。多數(shù)微rna具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。線蟲的lin-4[3]和let-7[4]是最早被發(fā)現(xiàn)的微rna,它們參與調(diào)控線蟲的發(fā)育時(shí)序,后來將類似的rna統(tǒng)稱為微rna。微rna具有重要的調(diào)控功能,與生物體的階段性發(fā)育密切相關(guān)。隨著研究的深入,已發(fā)現(xiàn)微rna在生命起源和早期進(jìn)化、基因復(fù)雜性、疾病機(jī)理等方面的研究中具有更為深遠(yuǎn)的意義。
近年來,德國(guó)、英國(guó)、美國(guó)3個(gè)實(shí)驗(yàn)室[5-7]利用生物信息學(xué)、cdna文庫(kù)及分子克隆技術(shù),在不同生物體細(xì)胞中克隆到包括lin-4和let-7在內(nèi)的約150個(gè)21～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子rna。這些rna具有極強(qiáng)的調(diào)控作用,與生物體的階段性發(fā)育密切相關(guān),并意識(shí)到這是一個(gè)極為廣闊的小分子rna世界。
2小rna的特征
截至目前,人們認(rèn)為小rna具有以下幾個(gè)特點(diǎn):一是小rna是長(zhǎng)21～25個(gè)核苷酸的單鏈,非編碼蛋白的短序列rna,本身不具有開放閱讀框及蛋白質(zhì)編碼基因的特點(diǎn),而是由獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)成熟的小rna,有5′磷酸和3′羥基。二是具有高度的保守性。小rna在進(jìn)化過程中保持著“謹(jǐn)慎”的態(tài)度。一些小rna的基因在進(jìn)化中呈保守的趨勢(shì),在不同生物間行使同一功能,這些基因稱為直向同源基因。三是在不同組織、不同發(fā)育階段中,小rna的水平有顯著差異,一些小rna呈時(shí)間發(fā)育特異性。四是小rna絕大多數(shù)位于已知基因序列的外圍,還有一些是成簇的,且簇生排列的基因往往協(xié)同表達(dá)。五是成熟的小rna由dicer酶從折疊的發(fā)夾狀前體約60個(gè)核苷酸的一條臂上切割得來。
3小rna的功能
小rna有組織特異性,可能在調(diào)控基因表達(dá)及個(gè)體發(fā)育中起著重要作用,動(dòng)物基因組中小rna的豐富性和表達(dá)模式的多樣性,表明它們廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控[8],還可能以多種調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮作用[9]。小rna序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性使其可能作為蛋白質(zhì)編碼rna的調(diào)節(jié)子,對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控及至個(gè)體發(fā)育產(chǎn)生重要影響。生物個(gè)體中的一群小rna,可通過自身的rna干擾機(jī)制在生命過程的各個(gè)階段關(guān)閉或調(diào)控基因表達(dá)水平,從而控制細(xì)胞的多種生命活動(dòng),尤其在發(fā)育過程中。
4小rna的作用機(jī)制
小rna能通過risc以2種后轉(zhuǎn)錄的機(jī)制之一來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。當(dāng)mirna進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中的risc復(fù)合物,如果成熟的mirna識(shí)別并與目的mrna序列高度互補(bǔ)配對(duì),那么mirna能使rna在互補(bǔ)區(qū)特異斷裂,并且斷裂位點(diǎn)與小干涉 rna的相同,即在與mirna第10、第11個(gè)殘基配對(duì)的mrna的核苷酸處;如果mirna與目的mrna的配對(duì)不是很精確,那么mirna將抑制其翻譯過程從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。在mrna斷裂之后mirna還保持完整,并且能繼續(xù)識(shí)別和降解其他的mrna。近幾年人們對(duì)mirna的形成和作用機(jī)制已經(jīng)基本研究清楚,只是一些細(xì)節(jié)有待研究。
5研究展望
盡管小分子rna的研究飛速發(fā)展,但在基因調(diào)控的機(jī)制研究和在功能基因組學(xué)應(yīng)用方面還存在許多問題,如risc的組成、risc和dicer自身的調(diào)控等,小分子rna與轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系,小分子rna對(duì)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制等。隨著這些問題的解決,對(duì)功能基因組學(xué)的研究將更加快速和深入。
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中藥資源是我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，采用創(chuàng)新的理論和方法尋找和發(fā)現(xiàn)中藥新資源是中藥資源可持續(xù)利用研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。肖培根提出的藥用植物親緣學(xué)從理論上總結(jié)藥用植物的生物親緣關(guān)系，化學(xué)成分和療效（傳統(tǒng)療效和藥理活性）間的相關(guān)性[1-4]，該學(xué)科的建立對(duì)于開發(fā)中藥植物資源具有重要指導(dǎo)意義[5-7];系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)方法可用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的相關(guān)問題研究，可在組學(xué)水平拓展藥用親緣學(xué)的領(lǐng)域，由此衍生出藥用基因組親緣學(xué)的新概念。本文作者基于藥用親緣學(xué)的長(zhǎng)期研究積累，提出這一新概念。本文簡(jiǎn)述藥用親緣學(xué)的知識(shí)譜系，研究方法和范式轉(zhuǎn)換，展望藥用基因組親緣學(xué)的理論和實(shí)踐價(jià)值。選擇《中國(guó)藥典》2010年版收錄最多的毛茛科為例，可以對(duì)藥用基因組親緣學(xué)進(jìn)行深入的概念驗(yàn)證和實(shí)證研究。結(jié)合傳統(tǒng)藥物學(xué)知識(shí)積累（包括中藥藥性和功效知識(shí)）和藥理研究揭示的生物活性，在基因組，轉(zhuǎn)錄組和代謝組水平探討毛茛科及其重要族屬的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系，揭示藥用植物基因型和代謝表型，以及近緣種遺傳多樣性和化學(xué)多樣性的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。通過毛茛科示范研究，豐富藥用親緣學(xué)研究的內(nèi)涵，開放地吸收有關(guān)領(lǐng)域的新知識(shí)和新技術(shù)，促進(jìn)中藥資源學(xué)科的成長(zhǎng)。
近年隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物系統(tǒng)發(fā)育研究中開始采用基因組數(shù)據(jù)，因此出現(xiàn)一些新術(shù)語(yǔ)，如系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)（phylogenomics，基因組系統(tǒng)學(xué)/基因組親緣學(xué)）[8]， pharmacophylogenomics[9]，轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)（phylotranscriptomics）[10]等。系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)是進(jìn)化和基因組學(xué)的交叉學(xué)科，是將基因組數(shù)據(jù)用于進(jìn)化關(guān)系重建的綜合分析;藥用親緣學(xué)研究藥用生物（特別是藥用植物）的生物親緣關(guān)系，化學(xué)成分和療效（傳統(tǒng)療效和藥理活性）間的相關(guān)性;系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)方法可用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的相關(guān)問題研究，在組學(xué)水平拓展了藥用親緣學(xué)的領(lǐng)域（圖1）。系統(tǒng)學(xué)（親緣學(xué)）是生命科學(xué)各分支和交叉學(xué)科的根基所在，在中藥資源學(xué)、中藥鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)、中藥藥性、中藥毒理和民族藥等中藥學(xué)相關(guān)領(lǐng)域起到提綱挈領(lǐng)的作用。提出藥用基因組親緣學(xué)新概念，是因應(yīng)學(xué)科交融的大勢(shì)所趨，期望在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，運(yùn)用多學(xué)科新理念、新方法和創(chuàng)新的技術(shù)手段進(jìn)行跨學(xué)科綜合研究，推動(dòng)中藥資源學(xué)科理論建構(gòu)和實(shí)踐應(yīng)用，更好地服務(wù)于中醫(yī)藥現(xiàn)代化事業(yè)。
RAD.限制酶切位點(diǎn)相關(guān)的DNA; SNP.單核苷酸多態(tài)性; SSR.簡(jiǎn)單重復(fù)序列; EST.表達(dá)序列標(biāo)簽。
圖1 可用于藥用親緣學(xué)親緣關(guān)系推斷的組學(xué)數(shù)據(jù)
Fig.1 Omics data that could be used in the pharmacophylogeny inference
1 系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)
系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)是生物進(jìn)化和基因組學(xué)的交叉學(xué)科，是將基因組數(shù)據(jù)用于進(jìn)化關(guān)系重建的綜合分析，因此需要系統(tǒng)發(fā)育研究方法和基因組學(xué)技術(shù)的緊密配合。系統(tǒng)發(fā)育研究是比較分析單個(gè)基因或少數(shù)幾個(gè)基因序列[11-12]，也常結(jié)合其他類型數(shù)據(jù)，例如形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和植物化學(xué)[13-14]數(shù)據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)基于全基因組測(cè)序時(shí)代之前的分子系統(tǒng)學(xué)研究，通過比較全基因組序列或至少大部分基因組序列來全面獲取對(duì)進(jìn)化關(guān)系重建有用的信息[15]。目前該領(lǐng)域研究包括以下幾方面。
1.1 基因功能預(yù)測(cè)和進(jìn)化推演 現(xiàn)存植物已鑒明的307 700種，估測(cè)上限45萬(wàn)種，提示植物多樣性的潛在空間巨大。在進(jìn)化史上均經(jīng)歷多次全基因組倍增（WGD），倍增基因拷貝在基因組中通常以保守的同線塊（syntenic block）形式存在。在植物進(jìn)化過程中，基因組大小變化是一種相對(duì)頻繁的事件，這些變化一般并不與基因多少及順序變化相關(guān)聯(lián)?；驍?shù)量及順序的保守性稱為同線性。基因組倍增顯著影響新性狀起源（圖2），近年來植物次生代謝路徑多樣化與WGD有關(guān)的例子越來越多。倍增基因拷貝可以解釋萜類和硫代葡糖苷[16]等多基因路徑合成的次生代謝產(chǎn)物的多樣化過程。次生代謝基因的串聯(lián)倍增及隨后發(fā)生的亞功能化和新基因化過程進(jìn)一步增加了次生代謝產(chǎn)物的遺傳多樣性和化學(xué)多樣性，增強(qiáng)了植物適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變遷的能力，顯示了植物次生代謝產(chǎn)物化學(xué)空間在藥物發(fā)現(xiàn)方面的巨大潛力。被子植物（有花植物）中已發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物超過20萬(wàn)種，可能大部分源自復(fù)雜性狀的快速創(chuàng)新。
實(shí)線粗箭頭.同源多倍體效應(yīng);虛線箭頭.異源多倍體效應(yīng);細(xì)箭頭.2類多倍體共有效應(yīng);符號(hào).效應(yīng)的方向。
圖2 多倍體化對(duì)植物基因組和表型的影響
Fig. 2 Effects of polyploidization on the plant genome and the phenotype
通過比較核苷酸多樣性估計(jì)值和dN/dS考查甾體糖生物堿次生代謝基因經(jīng)受的選擇限制[17]，可解釋次生代謝多樣性。高通量的SNP芯片分型可能發(fā)現(xiàn)有信息SNPs，其不同組合可區(qū)分次代物含量高中低的不同代謝表型，對(duì)道地藥材研究具參考價(jià)值。禾本科苯并嗪類（Bx）基因倍增后發(fā)生重排，導(dǎo)致Bx1和2的新拷貝在禾本科共同祖先的一個(gè)染色體末端成簇[18]。成簇有利于相關(guān)基因共分離，末端染色體的定位既便于基因重排，也便于有關(guān)合成基因的進(jìn)一步征募。這些事件對(duì)于后續(xù)的Bx生合基因簇的進(jìn)化至關(guān)重要。系統(tǒng)發(fā)育分析提示雙子葉和單子葉植物的Bx生物合成途徑彼此獨(dú)立進(jìn)化，即趨同進(jìn)化。氰苷的生物合成途徑也存在類似的進(jìn)化現(xiàn)象[19]。對(duì)次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的深入研究有助于育種方案的理性設(shè)計(jì)，優(yōu)化藥用化合物的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)基于生物技術(shù)的生產(chǎn)流程優(yōu)化。
研究多基因家族的進(jìn)化時(shí)， 基因樹比物種樹更有助于了解成員基因的進(jìn)化歷史和基因倍增過程。通過對(duì)基因樹和物種樹沖突進(jìn)行解釋，可推測(cè)進(jìn)化機(jī)制，包括快速輻射分化、雜交/基因漸滲、不完全譜系分選、水平基因轉(zhuǎn)移、旁系同源基因、基因倍增/丟失以及基因重組等。這些進(jìn)化機(jī)制也可部分地解釋近緣物種的化學(xué)表型多樣性，有助于推測(cè)藥用化合物的來源和轉(zhuǎn)化路徑。對(duì)于次生代謝產(chǎn)物生物合成基因家族和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因家族均可在系統(tǒng)發(fā)育框架內(nèi)挖掘分析全基因組有關(guān)序列。
1.2 構(gòu)建和厘清物種進(jìn)化關(guān)系 例如基于桔?？?8個(gè)種葉綠體基因組的基因排列順序構(gòu)建系統(tǒng)樹[20]，從全新的角度闡述了桔?？?8個(gè)屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用高通量測(cè)序平臺(tái)獲得天南星科32屬線粒體基因組序列[21]，發(fā)現(xiàn)線粒體系統(tǒng)樹支持率低且與葉綠體系統(tǒng)樹不一致?；谌~綠體全基因組序列的系統(tǒng)樹表明水芋屬Calla和落檐屬Schismatoglottis在一個(gè)主枝基部聚在一起，得到形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)證據(jù)支持。植物線粒體DNA的基因順序可能進(jìn)化較快，但是核苷酸序列的進(jìn)化速率僅為動(dòng)物的1%。葉綠體DNA核苷酸序列的進(jìn)化速率比線粒體快3～4倍，目前在種間進(jìn)化關(guān)系研究中應(yīng)用最多，例如對(duì)菊分支植物（asterids）[22]、人參[23]、銀杏[24]、金殼果科[25]、金虎尾目[26]的研究。但是葉綠體全基因組數(shù)據(jù)不足以解決經(jīng)歷快速分化的類群，例如姜目[27]。結(jié)合大量核基因組數(shù)據(jù)全面分析十分必要。單拷貝基因在被子植物基因組中比較常見，肖培根研究組基于29個(gè)已測(cè)序基因組的高質(zhì)量數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)了單拷貝基因的大規(guī)模識(shí)別和進(jìn)化表征[28]。發(fā)現(xiàn)基因組倍增區(qū)塊（duplicate block）數(shù)量和單拷貝基因數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)。17%單拷貝基因位于細(xì)胞器基因組，GO注釋屬于結(jié)合（binding）和催化活性類別的較多。真雙子葉植物基因組中，單拷貝基因比非單拷貝基因具有更強(qiáng)的密碼子偏性。RNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)了部分單拷貝基因相對(duì)高的表達(dá)水平。與其他植物不同，禾本科基因組中單拷貝基因的密碼子有效數(shù)量（Nc）與密碼子第三位G+C含量（GC3）呈顯著負(fù)相關(guān)。Ka和Ks值提示進(jìn)化上單拷貝基因比非單拷貝基因更保守。對(duì)可變剪接的選擇約束（selective constraint），單拷貝基因弱于低拷貝數(shù)基因家族（1～10旁系同源基因）成員，但是強(qiáng)于高拷貝數(shù)基因家族（>10旁系同源基因）成員。聯(lián)用各基因組共有的單拷貝基因序列得到分辨力佳的系統(tǒng)樹。加上內(nèi)含子序列提高了分支支持率，但是得到的系統(tǒng)樹與未加時(shí)不一致。建樹時(shí)包括內(nèi)含子序列可能更適合較低的分類學(xué)水平。單拷貝基因和非單拷貝基因經(jīng)受的進(jìn)化約束明顯不同，有些表現(xiàn)出物種特異性，尤其在真雙子葉和單子葉植物間。
藥用植物多樣性是藥用植物與環(huán)境形成的生態(tài)復(fù)合體以及與此相關(guān)的各種生態(tài)過程的總和，有遺傳多樣性、化學(xué)多樣性、居群多樣性、藥用物種多樣性、根際微生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性等多個(gè)層次。對(duì)于物種不均勻分化程度較強(qiáng)的地區(qū)， 在解釋氣候生態(tài)因子與藥用植物多樣性之間的關(guān)聯(lián)時(shí)， 要充分考慮進(jìn)化過程的影響。如中國(guó)西南地區(qū)的“天空之島”[29]，在第四紀(jì)形成了豐富的藥用植物資源，許多藥用族屬仍處于激烈分化過程中，例如毛茛科鐵線蓮屬、烏頭屬、翠雀屬等。全葉綠體基因組數(shù)據(jù)是細(xì)胞器尺度的超級(jí)條形碼，可用其研究分布于不同地理位置的同一物種（例如道地藥材）的種內(nèi)變異[30]和地理親緣學(xué)。但葉綠體基因組只相當(dāng)于一個(gè)基因座，葉綠體基因組和核基因組在居群水平的應(yīng)用可為研究道地藥材起源，種內(nèi)分化時(shí)間和分化強(qiáng)度提供線索。種內(nèi)譜系關(guān)系的確立可重現(xiàn)居群的進(jìn)化歷史，是更細(xì)致的系統(tǒng)發(fā)育重建。
1.3 預(yù)測(cè)和追溯側(cè)向基因轉(zhuǎn)移 側(cè)向（水平）基因轉(zhuǎn)移在微生物進(jìn)化中廣泛存在的事實(shí)從根本上動(dòng)搖了生命之樹的假定形態(tài)[31]。已發(fā)現(xiàn)很多原核和真核生物間的側(cè)向基因轉(zhuǎn)移，相當(dāng)多藥用植物和其內(nèi)生細(xì)菌/真菌具有相似的次代物生物合成路徑，其隱含的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)規(guī)律有待揭示，這將有助于藥用植物和其內(nèi)生菌互作的研究，為開發(fā)植物藥資源提供參考。
郝大程等：藥用親緣學(xué)論綱――知識(shí)譜系，認(rèn)識(shí)論和范式轉(zhuǎn)換
2 轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)及其他
全基因組測(cè)序花費(fèi)高，對(duì)于重復(fù)序列占比大，雜合度高和非二倍體基因組，序列正確拼接組裝十分困難[32]。顯然大規(guī)模比較轉(zhuǎn)錄組研究更具可行性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)基于表達(dá)的mRNA，不包括內(nèi)含子信息，沒有重復(fù)序列和倍性的干擾。初始的轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)概念指多物種的基因共表達(dá)分析[10]，物種間進(jìn)化距離分析可基于轉(zhuǎn)錄組信息。顯然轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)也可應(yīng)用于藥用植物研究，例如從19種植物（包括虎杖、紅豆杉、銀杏、人參等藥用植物）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取50個(gè)單拷貝直系同源基因[33]，可用于系統(tǒng)樹構(gòu)建和進(jìn)化分析。從紫菜屬P. umbilicalis和P. purpurea的454焦磷酸測(cè)序獲得482個(gè)編碼紅藻植物門頭發(fā)菜綱紫菜屬Porphyra膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的EST序列[34]，發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)共生和與原生藻菌有關(guān)的水平基因轉(zhuǎn)移。此研究提供了海洋藻類鈉偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的分子特征和共調(diào)控機(jī)制。重建陸生植物和藻類的起源和進(jìn)化過程是植物系統(tǒng)發(fā)育的基本課題，對(duì)于理解關(guān)鍵適應(yīng)性性狀的產(chǎn)生十分重要。由于物種快速多樣化導(dǎo)致一些進(jìn)化關(guān)系分辨不清，少數(shù)幾個(gè)分子標(biāo)志明顯不夠，基因組尺度的數(shù)據(jù)顯著增加了有信息位點(diǎn)數(shù)量。中藥資源和中藥鑒定是應(yīng)用性很強(qiáng)的領(lǐng)域，盡管考慮的是中藥材，但應(yīng)避免一葉障目不見泰山的尷尬，全面挖掘中藥資源和物種的準(zhǔn)確界定都離不開其所在族屬完全物種取樣的分子系統(tǒng)學(xué)研究[35]。轉(zhuǎn)錄組代表能表達(dá)的那部分在功能上活躍的基因組，測(cè)序費(fèi)用的大幅降低和生信分析方法的改進(jìn)使得密集物種取樣的轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)研究成為可能。例如從92種streptophyte綠藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和11種陸生植物基因組序列中提取共有的直系同源基因[36]，用其中852個(gè)核基因（1 701 170個(gè)序列聯(lián)配位點(diǎn)）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)陸生植物和綠藻Zygnematophyceae為姊妹關(guān)系（圖3），地錢（liverwort）和地衣（moss）組成的分支與維管植物分支為姊妹關(guān)系，而角苔（hornwort）與所有非角苔陸生植物為姊妹關(guān)系，從而證偽了之前關(guān)于早期陸生植物進(jìn)化的假說。轉(zhuǎn)錄組親緣學(xué)加深對(duì)基本植物性狀進(jìn)化的認(rèn)識(shí)，包括藥用植物化學(xué)多樣性和相關(guān)生合路徑的進(jìn)化。
圖3 獲支持證據(jù)最多的陸生植物系統(tǒng)發(fā)育假說
Fig.3 Land plant phylogenetic hypothesis that has most lines of evidence
盡管只被應(yīng)用了極短的時(shí)間尺度，人工選擇已經(jīng)極大地改變了馴化植物的形態(tài)、生理、植化、生活史。比較RNA-seq數(shù)據(jù)可用于解析種植番茄和5個(gè)近緣野生物種間基因序列和基因表達(dá)差異[37]?；谛蛄胁町惏l(fā)現(xiàn)>50個(gè)基因經(jīng)受正選擇，數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平有顯著差異，許多是由于選擇壓力所導(dǎo)致。許多快速進(jìn)化基因與環(huán)境應(yīng)答和應(yīng)激耐受有關(guān)。野生和種植品系間光反應(yīng)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的大規(guī)模變化進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了環(huán)境輸入量對(duì)于基因表達(dá)進(jìn)化的重要性。人工定向雜交和間接有利于非同義替換的馴化和改良過程已經(jīng)極大地改變了番茄轉(zhuǎn)錄組。比較轉(zhuǎn)錄組有助于深入了解人工選擇和自然選擇對(duì)野生和種植品系的普遍效應(yīng)，基于轉(zhuǎn)錄組的親緣樹構(gòu)建有助于定量研究各近緣物種的起源時(shí)間和進(jìn)化歷程，這對(duì)藥用物種研究的重要性是不言而喻的。
類似地，基于蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，有蛋白質(zhì)組親緣學(xué)（phyloproteomics）[38]，但尚未用于植物研究。表觀基因組親緣學(xué)（phyloepigenomics）[39]在表觀遺傳修飾層面考查物種親緣關(guān)系，用于藥用植物研究將有新穎發(fā)現(xiàn)。宏基因組親緣學(xué)（phylometagenomics）[40]將可用于研究藥用植物根際微生物和植物內(nèi)生菌等。系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)對(duì)計(jì)算能力和分析方法提出了新的挑戰(zhàn)，故有計(jì)算基因組系統(tǒng)學(xué)。
3 藥用植物親緣學(xué)與藥用基因組親緣學(xué)
直系同源基因是在物種形成過程中由共同祖先基因演變來的分布于不同物種的基因，在藥物發(fā)現(xiàn)過程中有助于動(dòng)物模型的選擇和分析流程的建立。葛蘭素公司的Searls[9]首次使用pharmacophylogenomics一詞，認(rèn)為充分利用基因組數(shù)據(jù)挖掘直系同源基因，能更好地預(yù)測(cè)藥靶基因功能。比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的基因組，不僅可找到保守功能元件，包括蛋白編碼基因和非編碼序列，而且能發(fā)現(xiàn)基因功能的遷移，從而使研究者充分認(rèn)識(shí)物種間遺傳差異，避免選用不適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型和藥物篩選方案[15]。
Searls提出的pharmacophylogenomics是針對(duì)藥靶的研究，而本文作者提出藥用基因組親緣學(xué)，是在基因組及其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組和代謝組水平系統(tǒng)研究藥用植物的植物親緣關(guān)系-化學(xué)成分-療效（傳統(tǒng)療效及藥理活性）間的相關(guān)性的新興邊緣學(xué)科。藥用基因組親緣學(xué)在藥用植物領(lǐng)域可以有多方面的應(yīng)用：①基于基因組信息構(gòu)建不同尺度的生命之樹， 明確藥用植物類群間的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系;②利用基因組數(shù)據(jù)估算分化時(shí)間并重建地理分布區(qū)， 推測(cè)現(xiàn)存藥用植物/道地藥材的起源和空間分布格局及其形成機(jī)制;③基于時(shí)間樹， 結(jié)合生態(tài)、環(huán)境因素及代謝創(chuàng)新性狀， 探討藥用植物的多樣化進(jìn)程和成因;④揭示藥用植物多樣性的來源和格局， 基于生物多樣性探討藥用化合物（例如次級(jí)代謝產(chǎn)物）多樣性，促進(jìn)生合途徑解析和創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn);⑤預(yù)測(cè)藥用植物多樣性動(dòng)態(tài)變化， 提出相應(yīng)的保護(hù)性開發(fā)策略，促進(jìn)人工栽培和分子育種?？梢娽槍?duì)藥用植物的基因組親緣研究的內(nèi)容完全不同于Searls原初的概念，只是暫借用pharmacophylogenomics作為藥用基因組親緣學(xué)英譯。
本文作者擬整合形態(tài)分類數(shù)據(jù)、代謝組和化學(xué)分類數(shù)據(jù)、基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、藥理活性數(shù)據(jù)和傳統(tǒng)藥物學(xué)知識(shí)，探索以毛茛科藥用植物科屬為重點(diǎn)的藥用親緣學(xué)。毛茛科藥用植物在中藥學(xué)中的應(yīng)用源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，我國(guó)42屬約720種毛茛科植物中，有30屬約220種可供作藥用（《中國(guó)植物志》27卷24頁(yè)）。黃連、附子、烏頭、升麻、川木通等的原植物均屬毛茛科。民間廣泛使用的麻布七、水黃連、鐵破鑼、虎掌草、月下參、驢蹄草、星果草、白頭翁等中草藥也屬于毛茛科。據(jù)作者統(tǒng)計(jì)在《中國(guó)藥典》2010年版正文收錄10個(gè)法定種，附錄收錄另10種，另外在可見的地方標(biāo)準(zhǔn)中至少收錄了另外的20種[41]，共計(jì)40種，高于菊科、豆科等大科的收錄數(shù)量，居所有植物科中的第一位。毛茛科大部分族屬在我國(guó)均有悠久的藥用歷史，其防治疾病的科學(xué)價(jià)值經(jīng)歷了時(shí)間的考驗(yàn)。但目前對(duì)毛茛科的組學(xué)研究，尤其是基因組和轉(zhuǎn)錄組研究十分稀缺，對(duì)毛茛亞科多物種屬的近緣種間親緣關(guān)系了解較為粗淺，對(duì)唐松草亞科的一些多物種屬，如唐松草屬[14]、人字果屬[42]，了解更少。這一現(xiàn)狀也為進(jìn)行藥用基因組親緣學(xué)的實(shí)證研究提供了很多課題。
人字果屬約16種，分布于亞洲東部和喜馬拉雅山區(qū)。我國(guó)9種，分布于秦嶺以南的亞熱帶地區(qū)，均由肖培根和王文采在1960年代正式命名（1979《中國(guó)植物志》27卷472頁(yè)）。據(jù)不完全調(diào)查，本屬至少7種在分布地區(qū)的民間用作草藥，具有確切的功效[43]。例如耳狀人字果全草止咳化痰、消炎，蕨葉人字果根狀莖消腫解毒，縱肋人字果全草健脾化濕、清熱明目，人字果根狀莖清熱解毒、消腫。但是此屬在毛茛科中是研究較少的，其藥用價(jià)值值得深入挖掘。基于4個(gè)分子標(biāo)記和形態(tài)特征得到的系統(tǒng)樹提示，人字果屬與扁果草屬和擬扁果草屬聚為一支，而與耬斗菜屬、天葵屬、擬耬斗菜屬進(jìn)化距離較遠(yuǎn)[44]。從預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，人字果屬的化學(xué)成分獨(dú)具特色。擬選擇耳狀人字果、蕨葉人字果、縱肋人字果和人字果4種，進(jìn)行酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序（RAD-Seq）。只有分別帶有接頭1和接頭2的酶切位點(diǎn)周邊的DN段會(huì)得到有意義的擴(kuò)增，即為RAD標(biāo)簽（圖4）[45]。將所有RAD標(biāo)簽序列連起來即代表物種的簡(jiǎn)化基因組，可用于同屬物種或同種各居群的基因組親緣關(guān)系推斷。在進(jìn)化史近期發(fā)生快速輻射分化的同屬物種，往往由于有限幾個(gè)分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)不足和/或基因樹沖突，使得其親緣關(guān)系難以辨清。人字果屬和鐵線蓮屬以及毛茛目其他多屬均有此問題。以RAD-Seq為代表的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序能提供關(guān)于物種基因組進(jìn)化和雜交的全局觀點(diǎn)，且無需事先知曉物種基因組的完整序列?；诖颂剿鞯目茖W(xué)問題：4種人字果的基因組親緣關(guān)系是什么;粉背葉人字果（進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）與這4種人字果的親緣關(guān)系;化學(xué)分類與分子分類是否一致;如何從起源和進(jìn)化角度解釋;本屬與唐松草亞科其他屬的藥用親緣關(guān)系。
圖4 RAD-Seq技術(shù)路線
Fig.4 Schematic representation of RAD-Seq pipeline
在藥用親緣學(xué)框架下進(jìn)行中藥資源研究的一個(gè)代表性例證是關(guān)于烏頭屬的親緣學(xué)研究[46-47]。毛莨科烏頭屬全世界約有300余種，其中超過半數(shù)分布在中國(guó)。發(fā)現(xiàn)牛扁亞屬是以牛扁堿和C18-二萜生物堿為主的類群，由于其毒性中等，因而可從中尋找鎮(zhèn)痛、抗炎等新藥前體[46]。烏頭亞屬下唐古特烏頭系和圓葉烏頭系是以內(nèi)酯型二萜生物堿為主的類群，毒性較小，是新藥尋找的重點(diǎn)研究類群。褐紫烏頭系則以C20-二萜生物堿如光翠雀堿和宋果靈為主，雜有高度進(jìn)化的烏頭堿型二萜生物堿如烏頭堿等成分?；瘜W(xué)分類上不支持其獨(dú)立成為一個(gè)分支。顯柱烏頭系是以含大茴香酸酯基的烏頭堿型二萜生物堿以及塔拉薩敏和查斯曼寧胺醇類為主的類群，是塊根較大的“大烏頭”的主要來源，具大毒。烏頭系以含15-羥基的單酯、雙酯或多酯以及胺醇類烏頭堿型二萜生物堿為主，且酯基中無大茴香酸酯基，此系是草烏的主要植物來源，具大毒。顯柱烏頭系，烏頭系，興安烏頭系和蔓烏頭系可能代表烏頭亞屬進(jìn)化的類群。從二萜生物堿化學(xué)成分來看，露蕊烏頭亞屬與烏頭屬另外2個(gè)亞屬差別很大，結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育研究，形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)結(jié)果，支持其為一單獨(dú)屬，介于翠雀屬和烏頭屬之間[15，48]。基于細(xì)胞核和葉綠體DNA序列的分子系統(tǒng)樹將形態(tài)極相近的九系分為2個(gè)群[47，49]， 一為甘青烏頭系， 圓葉烏頭系， 保山烏頭系和短柄烏頭系，均非單系群而是彼此交織;另一為烏頭系， 興安烏頭系， 顯柱烏頭系， 蔓烏頭系和準(zhǔn)噶爾烏頭系，亦均非單系群， 化學(xué)分類數(shù)據(jù)支持此分群。為了烏頭資源的可持續(xù)利用和發(fā)現(xiàn)高效低毒的新化合物， 有必要將近年涌現(xiàn)的高通量技術(shù)用于烏頭研究?；蚪M學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將在促進(jìn)烏頭生物活性化合物研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
毛茛科是一個(gè)比較原始的真雙子葉植物類群，已知代表性藥用化合物包括芐基異喹啉生物堿、毛茛苷、三萜皂苷、二萜生物堿等。作者結(jié)合近年植物化學(xué)研究進(jìn)展，對(duì)毛茛科所含主要化學(xué)成分類型和分布進(jìn)行了系統(tǒng)歸納總結(jié)。毛茛苷和木蘭花堿在一些屬（例如毛茛屬、鐵線蓮屬、驢蹄草屬等）共存，而非交替出現(xiàn)[2]。結(jié)合了療效數(shù)據(jù)[50]的藥用親緣分析[7， 51]， 支持基于分子標(biāo)記和形態(tài)數(shù)據(jù)提出的分類系統(tǒng)[44]。毛茛科可分為5個(gè)亞科： 毛茛亞科、唐松草亞科、黃連亞科、黃毛茛亞科、白根葵亞科。毛茛亞科可分為10族。鐵線蓮屬與白頭翁屬和銀蓮花屬均屬于銀蓮花族，均含較多五環(huán)三萜皂苷;鐵線蓮屬還含有黃酮、花青素、木質(zhì)素、香豆素、生物堿等[52-53]，其中五環(huán)三萜皂苷已用于化學(xué)分類研究。升麻族中，類葉升麻屬和升麻屬的療效和化學(xué)成分相近， 因此兩屬的親緣關(guān)系也近[54]。由于它們果實(shí)的形態(tài)差異以及細(xì)胞學(xué)特征不同， 考慮這兩屬為升麻族植物的一個(gè)分支， 且類葉升麻屬較升麻屬更為進(jìn)化。從化學(xué)分類學(xué)的角度來看， 鐵破鑼屬含有特殊鐵破鑼皂苷可以成為一個(gè)獨(dú)立的分支?；诩?xì)胞核ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹支持以上分析[49，55]。黃三七屬既和鐵破鑼屬一樣含有五環(huán)三萜和鐵破鑼型環(huán)阿爾廷烷四環(huán)三萜類， 又和升麻屬、類葉升麻屬一樣含有吲哚生物堿， 因此認(rèn)為它是鐵破鑼屬和升麻屬、類葉升麻屬之間的過渡類型[54]?？蓮拿喛聘髯暹x擇10個(gè)代表種（貓爪草、小木通、美花草、星果草、驢蹄草、升麻、鐵筷子、黑種草、北烏頭、金蓮花），進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從組裝的Unigene中找到單拷貝直系同源基因（>400），聯(lián)用這些基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合化學(xué)和形態(tài)分類，藥理活性和傳統(tǒng)藥物學(xué)資料，考察轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在藥用親緣關(guān)系推斷中的可用性。近年藥用親緣研究還涉及小檗科[56]，百合科貝母屬[57]， 冬青科冬青屬[58]，五味子科[59]和唇形科鼠尾草屬[60]等。這些研究均需要在組學(xué)層面繼續(xù)深化。
4 結(jié)論與展望
中國(guó)文明醫(yī)藥智慧肇始于原始文化，當(dāng)時(shí)即有博物學(xué)知識(shí)的積累，包括對(duì)人居環(huán)境周邊的生態(tài)和動(dòng)植物的基本認(rèn)識(shí)，“神農(nóng)嘗百草，一日而遇七十毒”，這里便蘊(yùn)含著中藥資源學(xué)和藥用親緣學(xué)的萌芽。梳理中藥資源學(xué)知識(shí)譜系，1980年肖培根提出的藥用植物親緣學(xué)是年輕的成員，結(jié)合形態(tài)分類、化學(xué)分類、療效特征研究藥用植物，有可能發(fā)現(xiàn)自然界隱藏著的決定論的規(guī)律。技術(shù)哲學(xué)家唐?伊德認(rèn)為，技術(shù)的居間調(diào)節(jié)作用改變了人類直接經(jīng)驗(yàn)到的世界[61]，使得客觀對(duì)象的新特征能顯現(xiàn)出來，提供給人類一種新的視野。高精尖的實(shí)驗(yàn)技術(shù)仿佛沒有極限，基因組學(xué)，代謝組學(xué)和相關(guān)技術(shù)的涌現(xiàn)不斷刷新著對(duì)于中藥資源和藥用親緣關(guān)系的認(rèn)識(shí)，并正在促成研究范式轉(zhuǎn)換。新范式的形成將成為藥用基因組親緣學(xué)由概念走向成熟理論和實(shí)踐應(yīng)用的標(biāo)志。
藥用植物親緣學(xué)研究藥用植物的植物親緣關(guān)系，化學(xué)成分和療效（傳統(tǒng)療效和藥理活性）間的相關(guān)性[4]，交叉性和涉及多學(xué)科是其特點(diǎn)，故這門學(xué)科的成長(zhǎng)需要開放地吸收有關(guān)領(lǐng)域的新知識(shí)和新技術(shù)。藥用親緣學(xué)的研究領(lǐng)域廣泛，其背后更廣闊的背景是中國(guó)文明天人合一的古老智慧和中藥傳統(tǒng)文化積淀的博物學(xué)資源。藥用親緣學(xué)不是封閉的單一學(xué)科，而是圍繞藥用植物親緣關(guān)系展開多維度透視的交叉學(xué)科群，其研究范式開放，知識(shí)譜系不斷延伸，呈現(xiàn)快速發(fā)展態(tài)勢(shì)。藥用基因組親緣學(xué)（pharmacophylogenomics）擴(kuò)展了藥用親緣學(xué)研究的內(nèi)涵，可視為藥用親緣學(xué)的升級(jí)版，將有力推動(dòng)藥用植物資源的開發(fā)和可持續(xù)利用[62]，并期待其引領(lǐng)中藥資源實(shí)踐導(dǎo)向的交叉學(xué)科創(chuàng)新。
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前言：工業(yè)化進(jìn)程的加快，帶來了比較嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，不僅影響了經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，還給人們的健康造成了很大的威脅，因此，做好環(huán)境保護(hù)和污染治理工作，是可持續(xù)發(fā)展理念下社會(huì)各界普遍關(guān)注的問題。利用宏基因組技術(shù)，開展環(huán)境保護(hù)和污染修復(fù)，能夠取得良好的效果，而且不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次破壞。
1 宏基因組技術(shù)概述
宏基因組的概念最早出現(xiàn)了1998年，用以定義土壤細(xì)菌的混合基因組，經(jīng)過了十?dāng)?shù)年的發(fā)展和演變，現(xiàn)在的宏基因組指的是環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的綜合，也稱環(huán)境基因組或者元基因組。宏基因組的主要研究流程，是從自然環(huán)境中會(huì)，直接提取總DNA，經(jīng)純化及部分酶切后，接入到合適的載體中，確保其能夠在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下轉(zhuǎn)化為宿主菌，進(jìn)而形成全新的DNA文庫(kù)，結(jié)合功能檢索和序列分析等，可以針對(duì)獲得的克隆子進(jìn)行篩選，得到目的產(chǎn)物。這里針對(duì)其主要流程進(jìn)行簡(jiǎn)單分析[1]。
（1）環(huán)境樣本提?。涵h(huán)境樣本的質(zhì)量是宏基因組技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵所在，在環(huán)境樣本中，存在大量的有機(jī)和無極顆粒，微生物占據(jù)的比例很小，而且其一般都是與顆粒緊密依附，想要在充分保證目的基因完整的前提下，完全提取樣本中的DNA，對(duì)于相關(guān)技術(shù)有著極高的要求。在當(dāng)前的技術(shù)條件下，比較常見的兩種樣品提取方法包括原味裂解法和異位裂解法。
（2）載體選擇：載體的選擇關(guān)系著基因組轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的效率和效果，一般常見的載體包括了有質(zhì)粒、福斯黏粒、細(xì)菌人工染色體、哺乳動(dòng)物人工染色體等，在進(jìn)行選擇的過程中，主要參照對(duì)象是目的基因的大小以及是否有利于實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增和表達(dá)等。每一種載體都有著各自的優(yōu)勢(shì)和不足，在實(shí)際研究過程中，技術(shù)人員應(yīng)該結(jié)合具體的需求，對(duì)載體進(jìn)行合理選擇。
（3）宿主菌選擇：目的基因在連接載體之后，需要轉(zhuǎn)化成宿主菌，然后才能夠進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的篩選工作，得到各種酶和生物活性物質(zhì)，從這個(gè)角度分析，想要實(shí)現(xiàn)重組基因的高效克隆和表達(dá)，宿主菌的選擇是非常重要的前提條件，在進(jìn)行選擇的過程中，必須考慮轉(zhuǎn)化效率、穩(wěn)定性以及載體在宿主菌中的表達(dá)性等。
（4）宏基因組文庫(kù)篩選：宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建，主要目的是從中獲取豐富的基因資源，實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物活性物質(zhì)的挖掘。不過，在環(huán)境樣品中，微生物的種類極其繁雜，文庫(kù)的容量巨大，如何對(duì)功能基因進(jìn)行有效篩選，是研究人員必須深入探索的問題。就目前來看，經(jīng)過長(zhǎng)期的發(fā)展，宏基因組文庫(kù)的篩選方案有幾種，包括序列驅(qū)動(dòng)篩選、功能驅(qū)動(dòng)篩選、底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選以及化合物結(jié)構(gòu)篩選等。如果想要獲取更多的信息，可以同時(shí)應(yīng)用多種篩選方法，通過優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提升宏基因組文庫(kù)的篩選效率[2]。
2 宏基因組技術(shù)在環(huán)境保護(hù)和污染治理中的應(yīng)用
對(duì)于環(huán)境的保護(hù)和污染的治理，一直都是社會(huì)各界普遍關(guān)注的問題，最近幾年，伴隨著微生物學(xué)的發(fā)展，生物修復(fù)技術(shù)逐漸成為了污染修復(fù)的熱門技術(shù)，主要是利用細(xì)菌、真菌以及一些微生物、植物等，通過自然代謝，對(duì)環(huán)境中的污染物進(jìn)行清除，利用生物的分解能力，實(shí)現(xiàn)污染修復(fù)的目的。
2.1降解基因及功能菌株的挖掘
相關(guān)研究表明，在環(huán)境中可供培養(yǎng)的微生物僅僅占據(jù)為微生物總量的1%-10%，而僅僅依照這些資源來對(duì)新的物種和基因進(jìn)行發(fā)掘，顯然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。結(jié)合宏基因組技術(shù)，可以從環(huán)境樣本中進(jìn)行基因組DNA的提取和克隆，從而實(shí)現(xiàn)了直接從自然界獲取遺傳信息，因此理論上能夠獲取任意序列的基因，既可以借此發(fā)現(xiàn)新物種，也可以合成新的物質(zhì)。從這個(gè)角度分析，在環(huán)境保護(hù)和污染治理中應(yīng)用宏基因組技術(shù)，具有較高的可行性。
很多環(huán)境污染，尤其是水體污染，溫度相對(duì)較低，并不適合常規(guī)微生物的生存，傳統(tǒng)的生物修復(fù)技術(shù)無法起到良好的效果。應(yīng)用宏基因組技術(shù)，可以篩選出一些在低溫條件下具備良好生存能力和生物活性的微生物，實(shí)現(xiàn)污染的治理和修復(fù)，如海洋石油降解、重金屬低溫修復(fù)等。同樣，在高溫、酸堿等極端環(huán)境中，宏基因組技術(shù)的應(yīng)用同樣能夠起到良好的污染修復(fù)效果。就目前而言，在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，遺傳工程是最活躍一個(gè)分支，可以將宏基因組中分離出的基因元件組編織成具備降解污染物功能的基因簇，取代原本的化工物，或者直接針對(duì)環(huán)境中的污染物質(zhì)進(jìn)行降解。必須注意一點(diǎn)，基因工程菌在實(shí)際應(yīng)用前，需要做好功能穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性以及生態(tài)安全性的檢驗(yàn)，確認(rèn)無誤后才能用于污染治理[3]。
2.2生物種群多樣性的分析
在全球環(huán)境變化研究中，生物的多樣性和變化性一直都是備受關(guān)注的課題，針對(duì)微生物種群的多樣性及相關(guān)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是現(xiàn)代環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)的一個(gè)重要手段。宏基因組技術(shù)的應(yīng)用，能夠幫助研究人員充分了解環(huán)境樣品中微生物的多樣性，結(jié)合其中的總DNA提取方法，可以了解微生物與被污染環(huán)境的互作關(guān)系，明確污染程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)于環(huán)境的監(jiān)控和評(píng)價(jià)。例如，Treusch等研究人員從森林土壤以及沙地生態(tài)系統(tǒng)中提取DNA，構(gòu)建出了3個(gè)大片段Fosmid基因文庫(kù)，對(duì)古細(xì)菌多樣性進(jìn)行了明確揭示；黃立南等人采用擴(kuò)展性rDNA限制性酶切片段分析法，針對(duì)廣州市北郊的李坑垃圾填埋場(chǎng)滲濾液中存在的古細(xì)菌群落進(jìn)行了研究和分析，從中初步獲取了垃圾填埋內(nèi)部古細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性的信息。
伴隨著研究的不斷深入，證實(shí)了環(huán)境的變化會(huì)對(duì)生物物種產(chǎn)生影響，同時(shí)，處于隔離狀態(tài)的單一物種會(huì)主動(dòng)對(duì)環(huán)境變化作出響應(yīng)，不過其與存在各類互作關(guān)系時(shí)的結(jié)果有著很大的差異性。只有在基因組水平上，對(duì)環(huán)境脅迫銀族以及微生物群落的組成關(guān)系進(jìn)行深入研究，才能對(duì)生物、環(huán)境以及生態(tài)之間的相互關(guān)系進(jìn)行明確，了解其動(dòng)態(tài)變化，為環(huán)境的保護(hù)、檢測(cè)、預(yù)警、評(píng)價(jià)及治理提供可靠依據(jù)[4]。
3 結(jié)語(yǔ)
總而言之，利用宏基因組技術(shù)，可以獲取生物多樣性的相關(guān)信息，這些信息在環(huán)境監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用，不過，考慮到宏基因組技術(shù)研究實(shí)踐尚短，存在著大量亟待解決的技術(shù)難題，加上其本身的研究涉及范圍光、工程量巨大，應(yīng)該對(duì)各種資源進(jìn)行整合，構(gòu)建環(huán)境樣品宏基因組共享數(shù)據(jù)庫(kù)，推動(dòng)多個(gè)學(xué)科的交叉融合，使得宏基因組技術(shù)在環(huán)境保護(hù)和污染治理方面的作用能夠得到最大限度的發(fā)展。
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【關(guān)鍵詞】 江西省 梔子 種質(zhì)資源
梔子 Gardenia jasminoides Ellis又名黃梔子、紅梔子、山梔，為茜草科多年生常綠灌木，喜溫暖濕潤(rùn)、陽(yáng)光充足的環(huán)境，較耐旱，忌積水［1］。以果實(shí)入藥，具瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效，用于熱病心煩、黃疸尿赤、熱淋澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛［2］?，F(xiàn)代研究表明梔子還有利膽作用、止血作用、鎮(zhèn)靜、降溫作用、抗病原微生物作用、抗炎作用、降血壓作用等［3］。除藥用外，梔子還是重要的天然黃色素原料，被廣泛應(yīng)用于食品、化工等行業(yè)。目前純天然黃色素在食品業(yè)、染色業(yè)中所占比例僅為10%， 而國(guó)內(nèi)每年以20%～30%的需求速度增長(zhǎng)，市場(chǎng)價(jià)格長(zhǎng)期趨勢(shì)穩(wěn)中有漲，因此目前種植梔子的前景比較看好［4］。
1 調(diào)查方法
江西是梔子的主產(chǎn)區(qū)之一，目前人工種植面積超過26 667 ha。贛中丘陵主要為紅壤，較適合發(fā)展梔子種植產(chǎn)業(yè)。本次調(diào)查是在前期文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，結(jié)合梔子的生物學(xué)特性和生態(tài)特性，以研究人員深入到各個(gè)縣、市為主，依靠當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)部門以及藥材部門為輔的方法進(jìn)行實(shí)地考察，并對(duì)目前江西省梔子種植規(guī)模較大的地區(qū)如新干、金溪、豐城、樟樹等地進(jìn)行重點(diǎn)考察。
2 調(diào)查結(jié)果
在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了江西省梔子主要用途有兩個(gè)，一是以新干縣、永豐縣、進(jìn)賢縣、臨川市等為代表的其梔子主要供提取色素用，二是以金溪、豐城、樟樹為代表的梔子加工為藥材供藥用。由于近年來大規(guī)模的人工種植，病蟲害明顯增多，梔子的抗性呈下降趨勢(shì)，產(chǎn)量、質(zhì)量也隨之下降，從而嚴(yán)重影響了江西梔子產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此，開展梔子種質(zhì)資源調(diào)查，收集優(yōu)良種質(zhì)，對(duì)開展梔子品種選育工作有重要意義，對(duì)人工栽培種植梔子出現(xiàn)的許多問題也能在一定程度上進(jìn)行改善；并且通過調(diào)查加強(qiáng)對(duì)我省野生梔子資源的保護(hù)。
2.1 江西梔子種質(zhì)分布情況在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，梔子在江西省是典型的野生廣布種，基本上每個(gè)縣市均有野生分布。通過對(duì)豐城、玉山等99個(gè)縣(區(qū))、市的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)除南昌市東湖區(qū)、西湖區(qū)、青云譜區(qū)、青山湖區(qū)外基本上每個(gè)縣（區(qū)）均有野生梔子分布；同時(shí)也了解到其中31個(gè)縣、市進(jìn)行了梔子的人工種植。人工種植梔子主要集中在以下幾個(gè)地區(qū)，吉安市的新干縣、永豐縣、峽江縣、吉安縣、泰和縣、永新縣一帶，其中又以新干縣和永豐縣為多，面積在約6 667 ha；撫州地區(qū)的金溪縣、臨川市、南城縣一帶，其中又以金溪縣和臨川市規(guī)模較大，面積達(dá)約10 667 ha；宜春市則主要集中在樟樹市、豐城市一帶，面積達(dá)約5 300 ha，其它地方如上高、高安等縣市也有一定的規(guī)模；九江市的武寧縣，上饒市的婺源縣，南昌市的進(jìn)賢縣，也有一定的種植規(guī)模，但大多處于初產(chǎn)期。調(diào)查過程中我們采集了356份梔子種質(zhì)樣品，供實(shí)驗(yàn)室研究用。在調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)了江西省在種植梔子時(shí)出現(xiàn)了許多問題，有的地方野生梔子資源遭到了嚴(yán)重的破壞。
2.2 梔子種質(zhì)資源類型從本次調(diào)查所收集的梔子種質(zhì)資源來看，江西省的梔子種質(zhì)資源可以從葉型、果實(shí)顏色、果實(shí)大小、果實(shí)形狀、果實(shí)成熟期、宿萼長(zhǎng)度及開張程度、樹形等方面來進(jìn)行分類，約有25種不同的類型。
2.2.1 葉的類型江西梔子種質(zhì)的葉型主要有：長(zhǎng)卵形葉、卵形葉和披針形葉等3種類型。
2.2.2 果實(shí)顏色類型江西梔子成熟果實(shí)的表面顏色主要有紅色、黃色、紅黃色、紫紅色4種類型。
2.2.3 果實(shí)大小類型江西梔子的果實(shí)根據(jù)其鮮果的重量大小可分為大果、中果、小果3種基本類型。
2.2.4 果實(shí)形狀類型江西梔子的果實(shí)外形主要有卵圓形、圓形和長(zhǎng)形3種基本類型。
2.2.5 果實(shí)成熟期根據(jù)果實(shí)成熟的時(shí)期可以分為早熟、中熟和遲熟3種基本類型。
2.2.6 宿萼長(zhǎng)度類型根據(jù)鮮果的宿萼長(zhǎng)度與果實(shí)長(zhǎng)度的比值來劃分，江西梔子的宿萼長(zhǎng)度類型有長(zhǎng)萼、中萼和短萼3種類型。
2.2.7 宿萼的開張程度根據(jù)鮮果的宿萼的開張程度可以分為開張、平行和閉合3種類型。
2.2.8 樹形的開張程度根據(jù)成年樹樹冠與地面的夾角可以分為直立、開張和匍匐3種基本類型。
3 種質(zhì)資源開發(fā)現(xiàn)狀和存在的問題
3.1 資源豐富，但加工技術(shù)落后，開發(fā)利用度低江西省的梔子資源比較豐富，特別是在前幾年隨著市場(chǎng)對(duì)梔子的需求量的增大，在江西的一些地方進(jìn)行了大規(guī)模的梔子種植，種植規(guī)模在26 667 ha以上，且野生資源分布廣，資源蘊(yùn)藏量大。但在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，許多個(gè)體戶對(duì)梔子的認(rèn)識(shí)不足，加工技術(shù)落后，開發(fā)利用度較小，部分種植戶采用原始的土法加工，操作不規(guī)范，如蒸的時(shí)間長(zhǎng)短不一致，從而導(dǎo)致梔子生熟不一致；如干燥過程中溫度過高，導(dǎo)致藥材品相不好等，這樣嚴(yán)重地影響了梔子藥材的質(zhì)量。還有部分地方種植的梔子僅供提取色素用，而對(duì)于其中的環(huán)烯醚萜苷類化合物如梔子苷等成分未加之提取，白白地浪費(fèi)了。由此可見種植個(gè)體戶對(duì)梔子有效成分的了解不夠，他們的知識(shí)水平還有待進(jìn)一步的提高。因此隨著市場(chǎng)對(duì)梔子的需求量逐漸達(dá)到飽和，價(jià)格也在逐漸趨于穩(wěn)定并呈下滑趨勢(shì)，如今年梔子鮮果的價(jià)格僅0.7～0.8元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前幾年，從而導(dǎo)致許多個(gè)體戶對(duì)梔子種植熱情明顯不足，管理就顯得很不關(guān)心，甚至有的地方出現(xiàn)了荒蕪現(xiàn)象。
3.2 科學(xué)管理水平不足在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多個(gè)體戶的管理水平非常缺乏，從而在種植梔子時(shí)顯得心有余而力不足，而且許多地方雖然大面積的種植梔子，但是管理的人員不僅少而且對(duì)專業(yè)知識(shí)了解很少。另外由于天氣的影響對(duì)梔子的影響也很大，但種植戶也不能運(yùn)用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)去減少天氣帶來的負(fù)效應(yīng)，未能做到未雨綢繆。只能靠天吃飯，年景好多收，年景差少收。
3.3 破壞生態(tài)平衡由于市場(chǎng)需求的逐漸飽和，而種植面積的逐漸增多，使得梔子的價(jià)格有下滑趨勢(shì)，從而在許多地方種植戶為了降低生產(chǎn)的成本，在病蟲害防治過程中使用了一些不符合藥材規(guī)范化種植的農(nóng)藥，影響了藥材的質(zhì)量，也對(duì)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)平衡產(chǎn)生了負(fù)面的影響。
3.4 收獲季節(jié)顯得雜亂無章在調(diào)查中研究人員發(fā)現(xiàn)在許多地方由于是大面積的種植，而目前梔子的采收主要依賴于人工，隨著大量的農(nóng)民工外出務(wù)工，農(nóng)村勞動(dòng)力明顯不足，因此許多種植戶為了能夠順利的完成采收任務(wù)，往往提前開始采收，從而使大量尚未成熟的梔子也被采收了，影響了梔子的質(zhì)量，從而對(duì)梔子上市產(chǎn)生了負(fù)面的影響。還有許多采藥人員為了達(dá)到完成采收任務(wù)，對(duì)梔子的采收不按科學(xué)方法進(jìn)行，導(dǎo)致梔子葉和嫩梢遭受損傷，從而嚴(yán)重影響來年的梔子生產(chǎn)。
4 梔子種質(zhì)資源開發(fā)利用的前景與措施
4.1 加強(qiáng)考察，提高梔子種質(zhì)資源的開發(fā)利用度江西省的藥材種植業(yè)在全國(guó)有較大的影響，如江西梔子、枳殼、車前等藥材的種植規(guī)模居全國(guó)之首。因此在對(duì)種植藥材的利用度方面要更加重視，因?yàn)檫@在一定程度上不僅影響了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展，也影響我國(guó)整體經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。在調(diào)查中，我省的許多地方對(duì)梔子的開發(fā)利用度甚微，因此農(nóng)、林、醫(yī)藥單位應(yīng)充分運(yùn)用現(xiàn)代化技術(shù)加大對(duì)梔子種植技術(shù)的研究，從而提高對(duì)該種質(zhì)資源的利用度。
4.2 加強(qiáng)投入，注重藥用植物種質(zhì)資源的研究與利用考察、收集和保護(hù)梔子種質(zhì)資源，其目的在于研究和充分利用其優(yōu)異性狀或優(yōu)異基因，以期更好服務(wù)于梔子種植業(yè)。近年來，國(guó)內(nèi)藥材種植業(yè)的發(fā)展一定程度受制于沒有較多突破性新品種的問世，而現(xiàn)有品種退化現(xiàn)象非常明顯，其關(guān)鍵在于沒有對(duì)藥用植物現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)的收集、整理和評(píng)價(jià)，從而影響了優(yōu)良品種的選育工作。因此加大力度，全面開展藥材種植業(yè)種質(zhì)資源的基礎(chǔ)研究，重點(diǎn)開展藥用植物種質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、比較基因組學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)及生物信息學(xué)等方面的研究，發(fā)掘和利用現(xiàn)有的優(yōu)異基因，進(jìn)行品種選育，從而培育出更多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗性強(qiáng)的新品種，服務(wù)于藥材種植業(yè)生產(chǎn)。
4.3 加大力度，重視梔子種質(zhì)資源遺傳多樣性的保護(hù)
在引進(jìn)新品種或進(jìn)行大面積種植的同時(shí)保留當(dāng)?shù)匾吧参镌械纳鷳B(tài)環(huán)境，使其不致因環(huán)境惡化或人為破壞而隨自然棲息地的消失而滅絕，并且只有在原有生態(tài)條件下保存這些植物，才能使它們?cè)谂c環(huán)境條件的相互作用下，不斷產(chǎn)生變異，從而演化出適應(yīng)惡劣條件的基因，為人類不斷發(fā)掘和利用這些基因提供來源。梔子在江西具有豐富的野生資源，蘊(yùn)藏了大量的優(yōu)良基因，但是這些優(yōu)良基因尚未進(jìn)行系統(tǒng)的收集、整理和評(píng)價(jià)，對(duì)于其中的優(yōu)良基因尚未獲取，因此加強(qiáng)對(duì)其的保護(hù)就勢(shì)在必行。而要真正保存這些優(yōu)良基因，首先就應(yīng)保護(hù)其原有的生態(tài)環(huán)境。
4.4 加強(qiáng)宣傳、教育、學(xué)習(xí)，提高種植個(gè)體戶的整體素質(zhì)
從調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，許多種植戶對(duì)梔子的認(rèn)識(shí)不夠，在資源利用上浪費(fèi)嚴(yán)重，此外部分種植戶為了獲取更大的利益，盲目擴(kuò)大種植規(guī)模，破壞了當(dāng)?shù)氐牡乇碇脖?，?dǎo)致水土流失比較明顯。因此各地政府，以及相關(guān)單位應(yīng)該抓好對(duì)當(dāng)?shù)厝嗣竦奈幕刭|(zhì)水平的建設(shè)、提高他們的環(huán)保意識(shí)等，讓人民對(duì)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)有一定的認(rèn)識(shí)，并運(yùn)用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)發(fā)展梔子種植業(yè)。
參考文獻(xiàn)
［1］孔令武，孫海峰.現(xiàn)代實(shí)用中藥栽培養(yǎng)殖技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000，12:310.
中圖分類號(hào)：TS41+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5248-05
Review and Prospect of Metabonomics in the Research of Tobacco Aroma Composition
FENG Ji，YU Jun，CAI Chang-chun
（Research Center of Tobacco Biotechnology Engineering， Hubei Tobacco Research Institute， Wuhan 430030， China）
Abstract： Metabonomics， developed from the late 20th century， is a new discipline comprehensively researching on all metabolites in organisms. It is to analyze qualitatively and quantitatively and reveal the mechanism of metabolism in organisms. Although metabonomics has been developing rapidly in recent decades， the application of metabonomics on research of tobacco （Nicotiana tabacum） aroma composition is still in the primary stage. The technical methods and progress on aroma composition in tobacco were reviewed； and the prospects of the application of metabonomics on the research of tobacco aroma composition were looked forward.
Key words： tobacco（Nicotiana tabacum）； metabonomics； aroma composition； crossed research
隨著煙草基因組測(cè)序的完成（測(cè)序品種為野生種絨毛狀煙草Nicotiana tomentosiformis、林煙草N. sylvestris和栽培種紅花大金元N. tabacum），人們逐漸從煙草結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（以建立高分辨率的遺傳和物理圖譜為主）向煙草功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)過渡。代謝組學(xué)（Metabonomics）是繼轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)的概念來源于代謝組，而要了解代謝組則必須先了解代謝（Metabolism）和代謝物（Metabolite）。代謝是指生物體內(nèi)所發(fā)生的用以維持生命的一系列有序的化學(xué)反應(yīng)總稱。在代謝過程產(chǎn)生或消耗的小分子物質(zhì)（分子質(zhì)量1 000 u以內(nèi)）叫做代謝物，不包括生物大分子物質(zhì)。因此，代謝物的分析是從分子水平上研究生物體生命活動(dòng)的一個(gè)重要突破口。代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)，對(duì)某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科[1]。
煙草中的香味物質(zhì)是以煙草植株體內(nèi)初生代謝前體物為原料，經(jīng)一系列酶的催化作用發(fā)生生理生化反應(yīng)所形成的一類次生代謝產(chǎn)物。目前從煙葉組織中已鑒定出的代謝物有3 000多種，其中與香味有關(guān)的代謝物有700余種[2]。這些香味物質(zhì)的分子里含有羥基、巰基等特定致香功能基團(tuán)，使煙葉組織散發(fā)出令人愉悅舒爽的香味。按照特定致香功能基團(tuán)不同，煙草香味物質(zhì)可分為有機(jī)酸類、酚類、脂質(zhì)類、甾醇類、萜類、雜環(huán)類等代謝物[3]。如此種類繁多的煙草香味代謝物給研究帶來了一定的困難。然而利用代謝組學(xué)的技術(shù)手段，將這數(shù)百種不同種類的香味物質(zhì)作為一個(gè)整體研究對(duì)象，通過高通量的分析儀器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的整合處理，從中了解和掌握煙草中所有香味物質(zhì)代謝變化規(guī)律，可有效地判斷和預(yù)測(cè)煙草香味物質(zhì)的代謝變化，為培育不同香型煙草品種服務(wù)。因此，將代謝組學(xué)研究技術(shù)應(yīng)用于煙草香味物質(zhì)研究中是十分必要的[4]。
1 代謝組學(xué)的技術(shù)原理
代謝組學(xué)研究技術(shù)具有高靈敏度、高通量和無偏向性等特點(diǎn)。近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIR）分析技術(shù)是近年來代謝組學(xué)研究領(lǐng)域快速發(fā)展的一種高效分析技術(shù)，該技術(shù)是將一束不同波長(zhǎng)的紅外射線照射到標(biāo)準(zhǔn)樣品上，某些特定波長(zhǎng)的紅外射線被樣品吸收而形成該樣品的紅外吸收光譜，然后利用近紅外光譜所反映的樣品基團(tuán)、組成或物態(tài)等信息構(gòu)建校正模型，以此來實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品的定性或定量分析。在煙草香味物質(zhì)研究中，研究人員收集數(shù)百份具有代表性樣品的光譜數(shù)據(jù)，以此建立相應(yīng)指標(biāo)的近紅外模型用于測(cè)定煙草重要香味成分。研究結(jié)果表明，近紅外光譜分析技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便、高效、低消耗的綠色分析技術(shù)用于測(cè)定煙草中重要香味物質(zhì)成分是可行的[5，6]。然而，該技術(shù)需要大量有代表性樣品建立模型，同時(shí)需要根據(jù)儀器的改變或標(biāo)準(zhǔn)樣品變化不斷更新模型，這些因素大大縮小了近紅外光譜分析技術(shù)的使用范圍。
色譜法是另一種高效的分析手段，具有高分辨能力、高靈敏度和高分析速度等特點(diǎn)，是分析復(fù)雜混合代謝物的主要手段[7]。但是在進(jìn)行定性和定量分析時(shí)，由于色譜法主要依據(jù)保留的出峰值，很難對(duì)那些未知復(fù)雜的代謝物做出定性分析，因此需要借助于其他儀器進(jìn)行輔助分析。而質(zhì)譜分析法是一種將分子電離成不同的帶電荷離子，然后按質(zhì)荷比將其分離和檢測(cè)，從而推斷分子結(jié)構(gòu)的分析方法[8]。雖然質(zhì)譜分析法具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)分析和鑒定能力，但是這種方法只能夠?qū)我坏慕M分給出良好的定性結(jié)果，對(duì)那些復(fù)雜混合的代謝物不具備分離解析能力。因此，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)既可以發(fā)揮色譜法和質(zhì)譜法各自的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也相互彌補(bǔ)了各自的不足。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）于1957年首次得以實(shí)現(xiàn)[9]，并且得到迅速的發(fā)展。該方法主要適合于復(fù)雜的混合代謝物中未知組分的定性分析，判斷代謝物的分子結(jié)構(gòu)。這種方法靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，但不足之處是對(duì)樣品中難揮發(fā)或是極性較大的代謝物進(jìn)行分析之前，需要將樣品經(jīng)過衍生化處理。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）可以很好地解決這個(gè)問題[10]。與GC-MS相比，LC-MS更適合于分析那些沸點(diǎn)高、分子大、熱穩(wěn)定差或極性強(qiáng)的代謝物。在已知的植物代謝物中大約70%的代謝物是不揮發(fā)的，因此LC-MS比GC-MS有更加廣闊的應(yīng)用前景。但是LC-MS和GC-MS各有所長(zhǎng)，應(yīng)相互補(bǔ)充。目前在煙草的香味物質(zhì)分析研究中，GC-MS的應(yīng)用較廣泛，大部分煙草香味物質(zhì)是由GC-MS分析技術(shù)檢測(cè)出來的[11]。
2 代謝組學(xué)在煙草香味物質(zhì)研究中的應(yīng)用
2.1 煙草香味物質(zhì)成分的鑒定
在20世紀(jì)五六十年代，科研人員就著手對(duì)煙草香味物質(zhì)成分進(jìn)行分離檢測(cè)，但由于分離檢測(cè)技術(shù)手段的限制，相關(guān)研究未能取得實(shí)質(zhì)性突破，人們對(duì)煙草香味物質(zhì)的認(rèn)識(shí)始終停留在初級(jí)水平。隨著氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜等代謝組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和普及，使得科研人員能夠在高通量水平上對(duì)煙草香味物質(zhì)成分進(jìn)行分離、鑒定以及相應(yīng)研究。1976年，Lloyd等[12]借助蒸餾萃取技術(shù)從烤煙煙葉和煙絲中提取出香精和精油，并將它們分成若干組分，利用GC-MS技術(shù)并結(jié)合近紅外、核磁共振等技術(shù)，對(duì)香精和精油中香味物質(zhì)進(jìn)行了研究，分離鑒定出羧酸類、醇類、醛類、脂類等共計(jì)12類323種代謝物（香精中含有195種，精油中含有228種），其中275種是在烤煙中首次發(fā)現(xiàn)的，132種未在其他類型煙草中被發(fā)現(xiàn)。Demole[13，14]等采用水蒸氣蒸餾、溶劑提取和真空蒸餾技術(shù)對(duì)白肋煙中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行提取，通過GC-MS技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)分析，共鑒定193種代謝物，其中81種代謝物首次在煙草中被鑒定，確定大馬酮和二氫大馬酮為重要的香味物質(zhì)。Schumacher[15]以馬里蘭煙為研究材料，利用GC-MS技術(shù)對(duì)其提取液進(jìn)行檢測(cè)分析，鑒定出142種馬里蘭煙香味物質(zhì)，并將這些香味物質(zhì)與烤煙、白肋煙的香味物質(zhì)進(jìn)行比較分析。
我國(guó)對(duì)煙草香味物質(zhì)成分分離檢測(cè)研究起步較晚，但近20年我國(guó)科研人員檢測(cè)煙草香味物質(zhì)成分的研究也取得了較大的進(jìn)展，分離鑒定出一批與煙草香氣有關(guān)的代謝物。劉百戰(zhàn)等[16]借助頂空分離法從不同部位、成熟度及顏色的云南烤煙中提取香味物質(zhì)，并利用毛細(xì)管氣相色譜技術(shù)對(duì)提取液進(jìn)行測(cè)定分析，共檢測(cè)到14種香味物質(zhì)。謝劍平等[17]采用蒸餾萃取技術(shù)從國(guó)產(chǎn)（湖北鶴峰、重慶奉節(jié)）和進(jìn)口（巴西、津巴布韋和馬拉維）白肋煙煙葉中提取出香味物質(zhì)，用GC-MS技術(shù)對(duì)提取液中的酸性、堿性和中性香味物質(zhì)進(jìn)行了分析，總共鑒定出200種香味物質(zhì)，其中有30種代謝物在煙草香味物質(zhì)研究中尚未報(bào)道。吳新華等[18]采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS/MS）技術(shù)并在多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，分離測(cè)定了7種煙草的香味物質(zhì)。
利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)煙草香味物質(zhì)成分的鑒定研究，在很大程度上提高了對(duì)煙草香味物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，證實(shí)了不同香型煙草間的香味物質(zhì)成分存在顯著的差異[19]。代謝組學(xué)研究技術(shù)為煙草香味物質(zhì)研究提供了一種準(zhǔn)確客觀的檢測(cè)技術(shù)，為今后深入研究不同煙草類型間、不同品種間、不同地方種植同一品種間主要香味物質(zhì)的差異及其形成原因提供了可能的手段。
2.2 不同基因型煙草香味物質(zhì)的比較
在影響煙草香味物質(zhì)合成與積累的因素中，基因型是最重要的因素，它可通過煙草體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控直接影響煙葉的香味[20]。如煙草品種的基因型存在缺陷，無論采取怎樣的栽培技術(shù)和其他措施，其體內(nèi)不產(chǎn)生或合成較少香味物質(zhì)，導(dǎo)致該煙草的香氣質(zhì)和量上都存在不足。因此，要獲得香氣品質(zhì)優(yōu)良的煙草品種，必須鑒別區(qū)分不同基因型煙草材料之間的香味物質(zhì)差異，對(duì)評(píng)價(jià)篩選優(yōu)良特色煙草材料有重要作用。常愛霞等[21]利用蒸餾萃取以及GC-MS技術(shù)對(duì)特香型烤煙、香料煙和烤煙3種類型的煙葉進(jìn)行了揮發(fā)性致香成分的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)特香型烤煙與烤煙的差異相對(duì)較小，而與香料煙存在著較大差異。汪耀富等[22]采用GC-MS技術(shù)對(duì)中國(guó)推廣種植的5個(gè)不同基因型烤煙品種的香味物質(zhì)含量進(jìn)行了比較分析，證明不同基因型烤煙葉片間香味物質(zhì)的含量差異較大。席元肖等[23]應(yīng)用LC和GC-MS技術(shù)，對(duì)中國(guó)18個(gè)產(chǎn)區(qū)68個(gè)產(chǎn)煙縣的初烤煙葉樣品的香味物質(zhì)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明香型烤煙的葉黃素、類胡蘿卜素、新綠原酸、蕓香苷等共13種香味物質(zhì)的含量顯著較高；濃香型烤煙的綠原酸、香葉基丙酮、苯乙醛、苯甲醛、巨豆三烯酮等共7種香味物質(zhì)的含量顯著較高；中間香型烤煙大部分香味物質(zhì)含量居中。因此，基因型對(duì)目標(biāo)香型烤煙品種的選育有十分關(guān)鍵的影響。
2.3 不同生態(tài)環(huán)境煙草香味物質(zhì)的比較
煙草中香味物質(zhì)合成與積累易受外界環(huán)境影響，光照、溫度、水分、海拔、氣候等因素是影響煙草香味物質(zhì)的重要因素[24]。因此，監(jiān)測(cè)不同環(huán)境中的煙草香味物質(zhì)的變化，可以了解不同的外界環(huán)境對(duì)煙草體中香味物質(zhì)合成與積累的影響。楊興有等[25]使用NIR、HPLC和GC-MS分析技術(shù)對(duì)不同光照處理過的烤煙材料進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，中性香味物質(zhì)總量隨光照減弱而明顯增加，但當(dāng)光照減弱到一定程度，中性香味物質(zhì)又開始減少。水分是煙草生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的條件，但降水量和土壤中水分含量對(duì)煙草煙葉香味物質(zhì)的影響卻是相反。例如采用HPLC分析技術(shù)對(duì)煙草葉片的香味物質(zhì)進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)增加田間灌水量能顯著提高煙草葉片產(chǎn)生香味物質(zhì)，而降雨則能淋洗大量煙葉表面脂溶性香氣物質(zhì)[26，27]。楊虹琦等[28]采用HPLC分析技術(shù)對(duì)來自于云南、貴州、福建、河南、黑龍江5省共10個(gè)地區(qū)的煙葉材料進(jìn)行分析。研究表明，隨著緯度的降低和海拔高度的升高，烤煙中類胡蘿卜素含量逐漸升高。
2.4 不同栽培與調(diào)制方式煙草香味物質(zhì)的比較
不同栽培措施對(duì)煙草中香味物質(zhì)合成與積累影響較大，只有根據(jù)各煙區(qū)自身的環(huán)境條件，找到合適的栽培方式，最大限度地發(fā)揮各煙區(qū)的自然優(yōu)勢(shì)，使各煙區(qū)煙葉具有不同風(fēng)格特色的香味。例如煙草種植密度和葉片數(shù)影響著煙葉中性香味物質(zhì)的含量。因此，趙銘欽等[29]采用GC-MS分析技術(shù)在延邊煙區(qū)對(duì)種植密度和留葉數(shù)不同的煙草進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，不同種植密度和留葉數(shù)對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)含量的影響不同，其中當(dāng)密度為120 cm×50 cm、留葉數(shù)為18片/株時(shí)，煙葉中性香味物質(zhì)含量最高，香氣質(zhì)量較好，適宜在延邊煙區(qū)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
煙葉調(diào)制過程是香味物質(zhì)前體物降解、香味物質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化的主要時(shí)期。因此探索優(yōu)化調(diào)制過程中的條件，最大限度促使煙葉內(nèi)香味物質(zhì)前體物大量轉(zhuǎn)化，使得更多的特色香味物質(zhì)彰顯出來。Weeks等[30]運(yùn)用GC-MS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)煙葉在調(diào)制過程中香味物質(zhì)新植二烯含量顯著增加，但陳化時(shí)間過長(zhǎng)，其含量則下降，表明新植二烯可發(fā)生進(jìn)一步代謝反應(yīng)。宮長(zhǎng)榮等[31]利用GC-MS技術(shù)研究不同烘烤條件下的煙葉香味物質(zhì)含量，認(rèn)為以低溫慢烤煙葉中香氣物質(zhì)損失較少，內(nèi)在品質(zhì)較好。
2.5 代謝組學(xué)與其他學(xué)科的交叉應(yīng)用
隨著各個(gè)學(xué)科研究的深入，科學(xué)家們逐漸認(rèn)識(shí)到基因組、表達(dá)組和蛋白質(zhì)組水平上的變化不一定能夠?qū)煵菹阄段镔|(zhì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的影響。而煙草體代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物才是煙草體中新陳代謝的最終結(jié)果，能夠準(zhǔn)確反映煙草體中狀態(tài)，因此只有將各個(gè)學(xué)科所獲得的相關(guān)信息聯(lián)系起來，才能從整體水平研究煙草香味物質(zhì)對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)[32]。任何單一方面的研究對(duì)煙草香味物質(zhì)的理解都是不全面的，因此煙草代謝組學(xué)與其他學(xué)科的交叉研究是必然趨勢(shì)。
將代謝輪廓分析與遺傳學(xué)、基因組學(xué)結(jié)合在一起展開研究，是煙草代謝組學(xué)與遺傳學(xué)、基因組學(xué)交叉領(lǐng)域新興的研究方向。常愛霞等[33]采用蒸餾萃取和GC-MS分析技術(shù)，對(duì)有特殊香氣大白筋599和具有一般香氣的G28烤煙煙葉進(jìn)行全面代謝輪廓分析，共檢測(cè)到67種香味物質(zhì)，其中55種為二者共有，且大白筋599有25種香味物質(zhì)含量高于G28。剩下12種香味物質(zhì)為品種特有，其中8種為大白筋599所特有，4種為G28所特有。進(jìn)一步的遺傳分析表明大白筋599的特異香味物質(zhì)是由單顯性基因所控制。另外，有人采用代謝組學(xué)與基因組學(xué)研究方法對(duì)香料煙香味物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)香料煙特征性香味物質(zhì)是雪松-琥珀香，該代謝物受一個(gè)位于A染色體上的基因控制[34]。
由于煙草中大多數(shù)香味物質(zhì)的含量較低，通過育種工程增加某類物質(zhì)的含量需要漫長(zhǎng)時(shí)間且效果也不明顯，無法在短期內(nèi)快速有效地改善煙草的香味品質(zhì)。因此，通過基因工程技術(shù)將某些特定的基因?qū)霟煵莼蚪M內(nèi)或使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草而獲得轉(zhuǎn)基因植株，可以快速有效提高煙草的香味品質(zhì)[35]。李雪君等[36]采用GS-MS分析技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)法呢基焦磷酸合酶（Farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PS）基因煙草株系（K-4、K-6、K-17、K-35）和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏目竞鬅熑~中類胡蘿卜素含量及萜烯類香味物質(zhì)含量進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因煙草株系烤后煙葉中8種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物及茄酮、新植二烯含量都有不同程度的提高，結(jié)果表明外源FPS基因在煙草中的表達(dá)對(duì)煙草香味物質(zhì)的合成具有促進(jìn)作用，有利于煙葉品質(zhì)的提高。
結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)研究方法，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得高產(chǎn)細(xì)胞系，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基、激素、光照、溫度、脅迫因子等培養(yǎng)條件對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行處理，最終應(yīng)用代謝組學(xué)研究技術(shù)得到穩(wěn)定可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。Chappeil等[37]采用GC-MS分析技術(shù)對(duì)處理過的煙草懸浮細(xì)胞和未處理對(duì)照的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行分析，結(jié)果認(rèn)為向煙草懸浮細(xì)胞中加入真菌細(xì)胞壁碎片后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中香味物質(zhì)倍半萜產(chǎn)物的積累增加。
3 展望
代謝組學(xué)是進(jìn)行煙草香味物質(zhì)研究的主要手段之一，目前在煙草香味物質(zhì)的檢測(cè)分析以及相關(guān)基因功能的研究等方面取得了很大的成功。但從總體來看，代謝組學(xué)在煙草香味物質(zhì)研究中的應(yīng)用仍然處于發(fā)展階段，在方法學(xué)和應(yīng)用兩方面均面臨著極大的挑戰(zhàn)。
在方法學(xué)研究方面，煙草香味物質(zhì)的復(fù)雜性使得研究人員對(duì)分析技術(shù)的靈敏度、分辨率、動(dòng)態(tài)范圍和通量提出了更高的要求[38]。代謝組學(xué)研究的深入得益于分析技術(shù)的不斷發(fā)展，如高分辨質(zhì)譜、超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用和多維核磁共振技術(shù)等的使用，為代謝組學(xué)在煙草香味物質(zhì)研究中的應(yīng)用提供了更加廣闊的空間。但是由于缺乏可通用的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，一定程度上限制了這些技術(shù)在煙草香味物質(zhì)研究中的應(yīng)用范圍。因此完善的煙草香味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建及相應(yīng)研究的標(biāo)準(zhǔn)化等越來越受到關(guān)注。在應(yīng)用方面，如何從大量的煙草香味物質(zhì)中找出特異性的香味物質(zhì)（特別是低豐度的香味物質(zhì)）是煙草代謝組學(xué)發(fā)展的瓶頸。能否克服此瓶頸是決定此技術(shù)能否廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要因素。
由于煙草代謝組學(xué)存在著這些制約因素，將煙草代謝組學(xué)與其他學(xué)科整合交叉研究，并且相互驗(yàn)證，是學(xué)科發(fā)展的必然趨勢(shì)。目前的研究均是將其他組學(xué)兩兩結(jié)合起來研究，如將其他學(xué)科全部結(jié)合成為一個(gè)有機(jī)體對(duì)煙草香味物質(zhì)進(jìn)行研究，將會(huì)使煙草香味物質(zhì)的研究提升到一個(gè)前所未有的深度。如“煙草基因組計(jì)劃”（我國(guó)《煙草行業(yè)中長(zhǎng)期科技發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中確定的9個(gè)科技重大專項(xiàng)之一）將大規(guī)模開展煙草基因組測(cè)序和全基因組序列圖譜的繪制、揭示基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制、闡明蛋白質(zhì)組分的表達(dá)及功能模式、探索代謝產(chǎn)物變化規(guī)律及構(gòu)建相應(yīng)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，以實(shí)現(xiàn)煙草基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等數(shù)據(jù)的整合，建立全面系統(tǒng)的煙草生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，提高對(duì)煙草復(fù)雜生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，這也是未來煙草香味物質(zhì)研究的重要趨勢(shì)[39，40]。
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一、代謝微生物概述
代謝組學(xué)(metabonomics/ metabolomics) 是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測(cè)技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別和專家系統(tǒng)等計(jì)算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法?；瘜W(xué)分析技術(shù)中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色譜(毛細(xì)管電泳)-質(zhì)譜聯(lián)用(X-MS)。目前代謝組數(shù)據(jù)處理的主要方法是:應(yīng)用主成分分析(PCA) 等將從原始圖譜信息或預(yù)處理后的信息進(jìn)行歸類，并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來;建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使各類樣品間達(dá)到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè);最終建立可利用的該領(lǐng)域的應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)和專家系統(tǒng)。應(yīng)用代謝組學(xué)可進(jìn)行疾病診斷、對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)和研究植物細(xì)胞代謝等。
二、代謝組學(xué)的研究方法
代謝物組學(xué)分析中，對(duì)于不同類型的代謝產(chǎn)物，往往要采取不同的分析方法進(jìn)行研究。目前，代謝物組學(xué)通常采用紅外光譜法( infraredspectroscopy ， IR) 、核磁共振( nuclear magneticresonance ， NMR)、質(zhì)譜(mass spectrometry ， MS) 、高效液相色譜( high performance liquidchromatography ， HPLC) 以及各種技術(shù)的耦聯(lián)，如氣象色譜耦聯(lián)質(zhì)譜( gas chromatography2mass spectrometry，GC/MS)和液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography2mass spectrometry，LC/MS)來分析研究代謝物并為其繪制圖譜。這些技術(shù)的耦聯(lián)可以提高對(duì)樣品的分辨率、敏感性及選擇度，有利于對(duì)更多的生物體系內(nèi)的代謝物繪制圖譜。一般來說，選擇代謝物組學(xué)分析方法時(shí)，其原則是要同時(shí)考慮儀器和技術(shù)的檢測(cè)速度、選擇性和靈敏度，找到一種最適合目標(biāo)化合物的方法。
三、代謝組學(xué)在微生物領(lǐng)域的研究進(jìn)展
(一)微生物分類，突變體篩選以及功能基因研究
經(jīng)典的微生物分類方法多根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)以及對(duì)不同底物的代謝情況進(jìn)行表型分類。最近，隨著分子生物學(xué)的突飛猛進(jìn)，基因型分類方法如16SrDNA測(cè)序，DNA雜交以及PCR指紋圖譜等方法得到了廣泛應(yīng)用。然而，某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會(huì)得出不同的結(jié)果。因此，根據(jù)不同的分類目的聯(lián)合應(yīng)用這兩類方法已成為一種趨勢(shì)。BIOLOG等方法在表型分類中應(yīng)用較為廣泛，但是，代謝譜分析方法(metabolic p rofiling)異軍突起，逐漸成為一種快速、高通量，全面的表型分類方法。采用代謝組分類時(shí)，可以通過檢測(cè)胞外代謝物來加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測(cè)方法為樣品衍生化后進(jìn)行GC2MS分析、薄層層析或HPLC2MS分析，最后通過特征峰比對(duì)進(jìn)行分類。Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開臨床病理來源以及實(shí)驗(yàn)室來源的不同桿菌(bacillus cereus)。除了表型分類外，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于突變體的篩選。在傳統(tǒng)研究中的沉默突變體(即未發(fā)生明顯的表型變化的突變體)內(nèi)，突變基因可能導(dǎo)致了某些代謝途徑發(fā)生變化，通過代謝快照(metabolic snap shot)可以發(fā)現(xiàn)該突變體并研究相應(yīng)基因的功能。
(二)發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化
發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測(cè)大量的參數(shù)，利用代謝組學(xué)研究工具可以減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量，提高檢測(cè)通量，并有助于揭示發(fā)酵過程的生化網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，從而有利于理性優(yōu)化工藝過程。Buchholz等采用連續(xù)采樣的方法研究了大腸桿菌在發(fā)酵過程中的代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)變化。他們?cè)谄咸烟侨狈Φ呐囵B(yǎng)液培養(yǎng)的大腸桿菌中加入葡萄糖，并迅速混勻，按每秒4～5次的頻率連續(xù)取樣。利用酶學(xué)分析、HPLC/LC2MS等手段監(jiān)測(cè)樣品中多達(dá)30種以上的代謝物、核苷以及輔酶，從而解析了葡萄糖以及甘油的代謝途徑和底物攝取體系。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建模，發(fā)現(xiàn)在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內(nèi)，大腸桿菌體內(nèi)發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經(jīng)典生化途徑相符，但隨后的過程則與經(jīng)典途徑不符，推測(cè)可能存在新的未知調(diào)控步驟。Takors認(rèn)為，通過上述代謝動(dòng)力學(xué)研究，掌握代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵參數(shù)，將直接有利于代謝工程的優(yōu)化，包括菌株的理性優(yōu)化以及發(fā)酵參數(shù)的調(diào)控。
(三)環(huán)境微生物研究
微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑。深入了解污染物在微生物內(nèi)的代謝途徑，將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件，從而實(shí)現(xiàn)快速的生物修復(fù)。這些代謝中間體大都通過萃取、分析方法進(jìn)行逐個(gè)研究，并借助專家經(jīng)驗(yàn)擬合出代謝途徑，其動(dòng)力學(xué)過程亦很少觸及。代謝組學(xué)方法的采用有可能改變這一現(xiàn)狀。Boersma等采用代謝組學(xué)方法研究氟代酚的微生物降解途徑。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振屬性，19F的核磁共振靈敏度與1H核相近;由于生物體內(nèi)無內(nèi)源性19F核磁信號(hào)，因而無本底干擾。所有19F核磁信號(hào)均可歸結(jié)于異生素及其代謝物。19F核的化學(xué)位移值寬，約為700ppm(1H為15ppm，13C為250ppm)。較寬的化學(xué)位移導(dǎo)致19 F在不同取代物的峰圖不易產(chǎn)生重疊。因此，借助核磁共振技術(shù)可以更方便地研究含氟化合物的代謝中間體。Boersma等根據(jù)總代謝物的核磁共振圖譜，推測(cè)出紅球菌內(nèi)羥化酶在不同的取代位(1，2，3三種不同的取代數(shù)量)羥基化氟代酚，然后再通過兒茶酚內(nèi)位雙加氧酶開環(huán)形成氟代粘糠酸的代謝過程。此外，他們還首次檢測(cè)到開環(huán)后的下游代謝物，即通過氯粘糠酸異構(gòu)酶生成氟代粘糠酸內(nèi)酯以及氟代馬來酸等中間代謝物。根際(rhizosphere)空間在植物2微生物相互作用中發(fā)揮著重要的作用。Narasimhan等利用根際代謝物組(rhizosphere metabolomics)方法，闡釋了植物分泌物對(duì)根際微生物降解多氯代酚( PCB)的作用機(jī)制。然而，在采用擬南芥突變體(產(chǎn)生較少的phenylp ropanoids)的對(duì)照組中，降解菌的數(shù)量較低，降解率也僅達(dá)50%。結(jié)果表明植物根際分泌的次級(jí)代謝物促進(jìn)降解菌的繁衍增殖，從而促進(jìn)了污染物的降解。
此外，微生物代謝組學(xué)還應(yīng)研究如何改進(jìn)樣品的制備方法。例如，在代謝組研究中，為了中止細(xì)胞代謝反應(yīng)采用冷淬火(cold quenching)方法，將細(xì)胞樣品迅速置于低溫(液氮或-70℃甲醇中)，這會(huì)導(dǎo)致許多微生物發(fā)生冷休克(cold2shock) ，釋放出大量的胞內(nèi)物質(zhì)，引起代謝組學(xué)定量研究發(fā)生偏差。
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轉(zhuǎn)基因大豆，是指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過基因工程方法導(dǎo)入外源基因所培育的具有特定性狀的大豆品種。轉(zhuǎn)基因大豆的研發(fā)是轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)的熱點(diǎn)之一，涉及的轉(zhuǎn)基因性狀包括對(duì)除草劑、蟲害、病害及干旱、鹽堿等環(huán)境逆境的抗性，以及油分、蛋白質(zhì)、活性物質(zhì)的含量和組成等，其中針對(duì)生產(chǎn)應(yīng)用開展的品質(zhì)改良和抗逆研究較多。
2 轉(zhuǎn)基因大豆?jié)撛诘慕】滴：?/p>
對(duì)于轉(zhuǎn)基因大豆及其制品的安全問題，業(yè)內(nèi)普遍的看法是：轉(zhuǎn)基因大豆的過敏性、毒性、 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改變、生態(tài)系統(tǒng)的影響以及生物多樣性的影響。
轉(zhuǎn)基因大豆由于其引入外部基因，可能更容易引起人體的過敏反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因大豆及制品導(dǎo)致過敏的事件屢見不鮮。另外，如果引入的抗生素標(biāo)記基因進(jìn)入人體，則有可能導(dǎo)致人體內(nèi)致病菌產(chǎn)生抗藥性，從而降低抗生素的臨床有效性，也可能使人體對(duì)很多抗生素產(chǎn)生抗藥性。
有研究表明，轉(zhuǎn)基因大豆的組成物質(zhì)與非轉(zhuǎn)基因大豆相比有較大的變化，如植物凝血素提高了約1倍，蛋白酶抑制劑高26.7%，而蛋白質(zhì)和苯丙氨酸明顯下降，維生素B2復(fù)合體膽堿的含量低29%等，這些組成物質(zhì)的變化可能會(huì)使人體生長(zhǎng)緩慢；轉(zhuǎn)基因大豆還含有一種類似雌性激素類化學(xué)物質(zhì)，它會(huì)影響人體荷爾蒙，導(dǎo)致人體生殖器官異常，并損害免疫系統(tǒng)。此外，有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因大豆食品與非霍奇淋巴瘤發(fā)病率的提高具有一定相關(guān)性。
3 轉(zhuǎn)基因大豆食品安全性評(píng)價(jià)
3.1 評(píng)價(jià)原則
評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因食品安全性，國(guó)際上廣泛采用的是1993年經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織（OCED）提出的實(shí)質(zhì)等同性評(píng)價(jià)原則，主要內(nèi)容包括生物學(xué)特性和營(yíng)養(yǎng)成分比較。但是以英國(guó)為代表的歐盟國(guó)家采用過程評(píng)價(jià)法，即采用嚴(yán)格的毒性、過敏性、抗性標(biāo)記基因的實(shí)驗(yàn)并對(duì)其應(yīng)用與發(fā)展采取嚴(yán)格的過程檢測(cè)作為安全評(píng)價(jià)的方法。目前國(guó)際上對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)基本遵循以科學(xué)為基礎(chǔ)、實(shí)質(zhì)等同性、個(gè)案分析以及逐步完善等原則。在實(shí)際檢測(cè)過程中要綜合運(yùn)用結(jié)果評(píng)價(jià)法、過程評(píng)價(jià)法、個(gè)案分析等。
3.2 評(píng)價(jià)內(nèi)容
3.2.1 營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)。比較轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與同/近基因型親本的傳統(tǒng)品種概略養(yǎng)分差異，包括粗蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、纖維素、維生素、礦物質(zhì)；全面分析氨基酸、脂肪酸的組成和含量變化；測(cè)定抗?fàn)I養(yǎng)因子含量。
3.2.2 過敏性評(píng)價(jià)。若導(dǎo)入基因來自已知含有過敏原的生物，其編碼的蛋白質(zhì)是在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用部分表達(dá)，則不論是常見或不常見的過敏原，均需確定該基因是否編碼某一種過敏原，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品用于食品時(shí)，還必須進(jìn)行人的臨床試驗(yàn)來確定其過敏性，如皮膚穿刺試驗(yàn)等。
[中圖分類號(hào)]S513 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1003―1650（2016）03―0099―01
1全球及中國(guó)轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)
2015年轉(zhuǎn)基因作物已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化種植20年，轉(zhuǎn)基因作物種植面積正在持續(xù)增加。據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織統(tǒng)計(jì)，截至2014年全球已有28個(gè)國(guó)家的1800萬(wàn)農(nóng)民種植了1.81億公頃的轉(zhuǎn)基因作物，是1996年種植面積的106倍。實(shí)踐表明，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。來自ISAAA的綜合分析表明，轉(zhuǎn)基因作物在1995年至2014年間產(chǎn)生了多重重大效益：采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)降低了37%的化學(xué)農(nóng)藥的使用率，提高了22%的作物產(chǎn)量，農(nóng)民利潤(rùn)增加了68%。
隨著中國(guó)的經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展以及農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，中國(guó)的糧食需求仍不斷增加，比如每年進(jìn)口玉米和大豆持續(xù)增加，而其中90%為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，特別是中國(guó)作為大豆的主要消費(fèi)國(guó)，進(jìn)口的大豆占全球出口總量的65%。一直以來，中國(guó)正積極推進(jìn)轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)工作，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米等作物的研發(fā)和未來的商業(yè)化應(yīng)用對(duì)中國(guó)和全球的糧食和飼料需求都有巨大的貢獻(xiàn)潛力。
2玉米轉(zhuǎn)化事件在全球商業(yè)化應(yīng)用現(xiàn)狀
轉(zhuǎn)化事件（GM event）是指在遺傳轉(zhuǎn)化過程中外源DNA與植物基因組DNA發(fā)生特異性重組進(jìn)而通過組織培養(yǎng)而得到的植株個(gè)體。因此，本文涉及的轉(zhuǎn)化事件不包括通過常規(guī)育種方法將不同的轉(zhuǎn)化事件聚合而得到的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因作物從研發(fā)到商業(yè)化應(yīng)用至少包括初級(jí)研發(fā)階段，高級(jí)研發(fā)階段，監(jiān)管階段，商業(yè)化預(yù)備階段及商業(yè)化應(yīng)用階段。初級(jí)研發(fā)階段包括基因挖掘，轉(zhuǎn)化事件的創(chuàng)制、篩選及評(píng)價(jià)，一般需要3-5年進(jìn)入高級(jí)研發(fā)階段；高級(jí)研發(fā)階段是指尚未進(jìn)入監(jiān)管階段的轉(zhuǎn)化事件，但已進(jìn)入研發(fā)階段的后期并為監(jiān)管申請(qǐng)?zhí)峁┰囼?yàn)數(shù)據(jù)，將在7-8年左右實(shí)現(xiàn)商業(yè)化；監(jiān)管階段是指已經(jīng)至少提交一個(gè)國(guó)家進(jìn)行監(jiān)管申請(qǐng)，并有可能在2―3年內(nèi)獲得許可并商業(yè)化應(yīng)用；商業(yè)化預(yù)備階段是指在全球范圍內(nèi)至少獲得一個(gè)國(guó)家規(guī)?；N植的許可，但尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)模化種植、生產(chǎn)和銷售，是否實(shí)現(xiàn)商業(yè)化取決于的研發(fā)商的決定；商業(yè)化應(yīng)用階段是指在全球范圍內(nèi)至少有一個(gè)國(guó)家實(shí)現(xiàn)規(guī)?；N植、生產(chǎn)和銷售。
目前已有16個(gè)轉(zhuǎn)化事件實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，涉及的性狀包括除草劑耐性（草甘膦，草銨膦），抗蟲性狀（鱗翅目害蟲，鞘翅目害蟲），生理性狀改良（水分利用效竄和品質(zhì)改良（淀粉酶含量）4類性狀。就目的基因而言，16個(gè)轉(zhuǎn)化事件共涉及Bt基因10個(gè)，在16個(gè)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化事件中，美國(guó)是全部批準(zhǔn)商業(yè)化種植的國(guó)家之一；在歐盟，MON810早在1998年就獲得商業(yè)化種植的許可，Bt11等12個(gè)轉(zhuǎn)化事件已獲得批準(zhǔn)用作加工原料，但尚未獲得批準(zhǔn)商業(yè)化種植3272，5307和Bt176等3個(gè)轉(zhuǎn)化事件尚未獲得批準(zhǔn)用作加工原料和商業(yè)化種植在中國(guó)，除了轉(zhuǎn)化事件5307以外的15個(gè)轉(zhuǎn)化事件均獲得進(jìn)口用作加工原料的許可。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2011年以來，我國(guó)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米逐年增加，2014年進(jìn)口500萬(wàn)噸。
3轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品線研發(fā)趨勢(shì)與展望
3.1玉米規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系日趨成熟
工廠化流水線式的規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系是獲得并實(shí)現(xiàn)玉米轉(zhuǎn)化事件商業(yè)化化應(yīng)用的平臺(tái)保障。玉米規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系采用的主要方法是基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。規(guī)?；霓D(zhuǎn)化體系需要高效的篩選體系，采用抗生素篩選標(biāo)記基因篩選玉米轉(zhuǎn)化事件存在安全性問題，利用雙T-DNA載體是一種較方便的刪除選擇標(biāo)記基因的方法，將選擇標(biāo)記基因和目的基因放置在2個(gè)T-DNA上，雙T-DNA在轉(zhuǎn)基因植株后代分離，篩選只含目的基因而不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株。比如，孟山都公司開發(fā)的MON810，MON863等轉(zhuǎn)化事件采用了上述策略刪除了抗生素標(biāo)記基因nptll。先正達(dá)公司開發(fā)的正向選擇系統(tǒng)――甘露糖異構(gòu)酶基因pm i篩選系統(tǒng)規(guī)避了后期通過同源重組刪除標(biāo)記基因的繁瑣步驟，如已經(jīng)商業(yè)化的玉米轉(zhuǎn)化事件MIR162，MIR604等。此外，隨著玉米轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化，除草劑耐性基因pat epsps等不僅可以作為目標(biāo)性狀而且可以作為篩選標(biāo)記用于玉米轉(zhuǎn)化事件的創(chuàng)制，如孟山都公司的MON88017，陶氏杜邦公司的TC1507等玉米轉(zhuǎn)化事件。
3.2功能基因改良及資源挖掘呈多樣化趨勢(shì)
