時(shí)間：2023-03-02 15:10:17
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二、折舊額的核算方法
（一）固定資產(chǎn)磨損價(jià)值貶值的量變規(guī)律。
為了正確地核算折舊額，即在通貨膨脹條件下，能抵補(bǔ)貨幣貶值的損失，在固定資產(chǎn)壽命期各個(gè)時(shí)間階段上所計(jì)算的折舊額之和，能夠滿足從使用價(jià)值上恢復(fù)原有固定資產(chǎn)規(guī)模的需要，這首先就需要分析固定資產(chǎn)磨損價(jià)值貶值的量變規(guī)律。
固定資產(chǎn)是長期使用的物質(zhì)資料，而生產(chǎn)性的固定資產(chǎn)是物質(zhì)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的勞動(dòng)資料。因而，固定資產(chǎn)再生產(chǎn)的過程是：
購置建造一交付使用一報(bào)廢一再購置建造。
從上述過程可以看出：建（購）置是固定資產(chǎn)原始價(jià)值的始點(diǎn)，報(bào)廢是固定資產(chǎn)原始價(jià)值的終點(diǎn)。在壽命期中，固定資產(chǎn)每年在提取折舊后，其金額必要產(chǎn)生一個(gè)無形貶值量。這個(gè)貶值量的變化過程可用公式表示如下：
式中：Z代表固定資產(chǎn)原值；Z’代表貨幣貶值的損失量；Y代表年折舊額；L代表物價(jià)上漲率；l，2…n代表時(shí)序；n代表固定資產(chǎn)使用年限。
在通貨膨脹條件下，為了避免固定資產(chǎn)貶值的損失，在核算折；日時(shí)，應(yīng)當(dāng)把貶值（Z’）加到折舊額中，進(jìn)入產(chǎn)品成本，待產(chǎn)品出售后，收回折舊以滿足更新固定資產(chǎn)的需要。
（二）核算折舊的公式設(shè)想。
上面從遞減折舊的觀點(diǎn)，考察固定資產(chǎn)逐年遞減的貶值量的變化規(guī)律的，但為了正確計(jì)算年折舊額，可以從另外一個(gè)角度觀察這個(gè)問題，即一方面以整個(gè)固定資產(chǎn)原值為基數(shù)，隨著時(shí)間的推移，由于通貨膨脹，貨幣貶值，可把逐年貶值量加到固定資產(chǎn)原值中去，使固定資產(chǎn)從其生命的始點(diǎn)到生命的終點(diǎn)，仍能保值。另一方面每年提取的折舊額，從第～年末開始，直至折舊終止為止亦逐年加進(jìn)一個(gè)貶值額，并假定固定資產(chǎn)在報(bào)廢時(shí)無殘值，則可建立如下公式：
把上述方程作為如下整理，則：
整理后簡得：
現(xiàn)仍以本文前面購買10輛汽車為例：
Z=100萬元，n=10年
則該批汽車的年折舊額為：
計(jì)算結(jié)果，每年提取13．8909萬元，在10年物價(jià)總水平上升87．186%的條件下，在10年后仍然能夠購買載重量為4噸的10輛載重汽車。然而按傳統(tǒng)的方法計(jì)算折舊，即100萬元10年=10萬元，在通貨膨脹條件下，所計(jì)算的折舊總額，是無法按照原有固定資產(chǎn)使用價(jià)值規(guī)模更新全部固定資產(chǎn)，即無法保證固定資產(chǎn)保值的。
三、核算折舊額的幾個(gè)具體問題
通過實(shí)例證明，筆者認(rèn)為上面所設(shè)計(jì)并經(jīng)過推導(dǎo)，論證所建立的在通貨膨脹條件下，計(jì)算折舊額的公式是科學(xué)的，但在應(yīng)用公式時(shí)，仍有下列問題需做進(jìn)一步的研究。
（一）價(jià)格指數(shù)的選擇。
通貨膨脹，物價(jià)上漲，這是一個(gè)普遍的問題。但在現(xiàn)實(shí)經(jīng)濟(jì)生活中，由于各種商品在國計(jì)民生中的作用不同，因而其物價(jià)上漲幅度是不相同的。因此，在我國實(shí)際工作中編制有各種性質(zhì)的價(jià)格指數(shù)。那么在計(jì)算固定資產(chǎn)折舊額時(shí)，應(yīng)當(dāng)采用哪種價(jià)格指數(shù)為宜呢？筆者認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)采用國家統(tǒng)計(jì)局編制的固定資產(chǎn)投資價(jià)格指數(shù)。這一指數(shù)綜合反映我國固定資產(chǎn)投資價(jià)格的變動(dòng)程度，而且與折舊額的聯(lián)系最為密切。
（二）固定資產(chǎn)貶值率總額。
固定資產(chǎn)折舊的計(jì)算是一個(gè)十分重要經(jīng)濟(jì)問題，它關(guān)系到正確評價(jià)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益與國家財(cái)政收入等問題。因此國家財(cái)政部門應(yīng)當(dāng)根據(jù)固定資產(chǎn)投資價(jià)格總指數(shù)與分類指數(shù)，考慮到未來一段時(shí)期內(nèi)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的趨勢，對價(jià)格變動(dòng)作出預(yù)測，并以定額參數(shù)的形式公布，供各企業(yè)計(jì)算折舊時(shí)采用。當(dāng)然我們不否認(rèn)制定定額參數(shù)即貨幣貶值的定額參數(shù)是十分復(fù)雜的工作。但為了保證這項(xiàng)工作的準(zhǔn)確性與科學(xué)性，可以在預(yù)測的基礎(chǔ)上經(jīng)有關(guān)專家討論，爾后經(jīng)有關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，再行公布采用。
（三）定額貶值率與實(shí)際貶值率的問題。
貨幣定額貶值率與實(shí)際貶值率是要發(fā)生離差的，因此，根據(jù)定額貨幣貶值率計(jì)算的折舊額和實(shí)際貨幣貶值率計(jì)算的數(shù)值之間，必須要產(chǎn)生一個(gè)差數(shù)，為此需要調(diào)整。一般來講，在年度執(zhí)行過程中，可按貨幣定額貶值率計(jì)算，待年終決算時(shí)，再根據(jù)實(shí)際貨幣貶值率進(jìn)行調(diào)整，其公式如下：
YI=Y[l＋（L1－L）]
式中：YI代表調(diào)整后的折舊額；Y代表按貨幣定額或預(yù)計(jì)貶值率折舊額；LI代表實(shí)際貨幣貶值率；L代表定額貨幣貶值率。
治療
本病屬于免疫系統(tǒng)疾病，治療該病癥必須增強(qiáng)免疫力，可以注射"免疫抑制劑"治療。
2護(hù)理
護(hù)理計(jì)劃及早制定?；純核家环N罕見的疾病，盡快確診，積極配合醫(yī)生迅速和有效地使所有援助檢查，皮膚科，兒科和其他科室會診。對這種嚴(yán)重的疾病評估，獲取相關(guān)信息，并與醫(yī)生的治療方案，孩子們組織討論，制定了詳細(xì)的護(hù)理計(jì)劃，認(rèn)真落實(shí)和不斷改進(jìn)的條件，并根據(jù)合理的謹(jǐn)慎措施轉(zhuǎn)變。
2.1發(fā)燒護(hù)理 密切觀察體溫變化，每天6次測量體溫恢復(fù)正常后3天，每天一次衡量，臥床休息，補(bǔ)充營養(yǎng)和液體的溫度后，及時(shí)更換汗?jié)褚路?，以防止滴濕疹的發(fā)生。
2.2心理護(hù)理 兒童有康復(fù)的強(qiáng)烈愿望，通過耐心說服，消除恐懼的治療，治療可以有意識地給予精神上安慰。為家長密切合作進(jìn)行治療。
2.3 高蛋白飲食和營養(yǎng)，高維生素，好食物和合理的原則，以改善機(jī)體健康。增加人體的耐受化療，提高免疫力。特殊治療時(shí)，如嘔吐，嚴(yán)重且難以考慮飲食或靜脈高營養(yǎng)消耗的元素，以確保病人有足夠的熱量，改善營養(yǎng)狀況。
2.4病人的病情在手術(shù)前仔細(xì)觀察，觀察腹部疼痛，位置，范圍，腹脹情況排氣排便情況的性質(zhì)，使快速，皮膚準(zhǔn)備，術(shù)前皮膚測試等，禁用止痛藥，以防掩蓋病情。
2.5 患者手術(shù)后回到病房，以枕平臥4?6小時(shí)，頭側(cè)面，保持呼吸通暢，必要時(shí)給予吸氧。麻醉前作出明確，監(jiān)測有無嘔吐，腹脹，排氣排便情況，保持引流通暢胃腸減壓生命體征及腹部癥狀密切觀察，并觀察引流液，顏色和數(shù)量的性質(zhì);禁止在食品，良好的口腔護(hù)理，根據(jù)醫(yī)生的意見合理補(bǔ)充水分和電解質(zhì)溶液;術(shù)后早期的半臥位，鼓勵(lì)早期活動(dòng)，防止腸粘連，這將有利于身體恢復(fù);蠕動(dòng)恢復(fù)。適當(dāng)?shù)娘嬍硲?yīng)少量多餐，逐漸結(jié)束，并觀察是否進(jìn)食后腹痛，腹脹，嘔吐等癥狀，如果上述癥狀，應(yīng)暫停進(jìn)食，看看是否有腸梗阻，吻合口狹窄等并發(fā)癥;該觀察傷口無出血，滲液，腫脹，保持傷口敷料清潔干燥，防止尿液污染傷口。
2.6藥物不良反應(yīng)及護(hù)理 對化療藥物的胃腸道不良反應(yīng)的各種觀測是普遍的。在化療前或口服止吐藥物化療期間的飲食，以減少惡心和嘔吐，靜脈注射30分鐘要輕和消化。做三查七對的。（1）長春新堿導(dǎo)致末梢神經(jīng)炎，皮膚，肌肉和關(guān)節(jié)四肢麻木，疼痛，腹痛，肝，腎功能表現(xiàn)應(yīng)該是保護(hù)，注意血液中的變化，低白血細(xì)胞分離應(yīng)該很好對各種感染的保護(hù);（2）高劑量甲氨蝶呤結(jié)合6 - MP的時(shí)間。使胃腸道反應(yīng)，口腔炎，口腔潰瘍惡化。重要的骨髓抑制，國會議員在6個(gè)半小時(shí)，晚飯后口服，每日一次，以減輕反應(yīng)，同時(shí)加強(qiáng)口腔護(hù)理，甲氨蝶呤輸液，可能含有冰或冷水，以減少口腔黏膜和菜，氨濃度的甲氨蝶呤（3）VP16的使用，應(yīng)密切觀察有無泄漏，一旦發(fā)現(xiàn)，應(yīng)立即停止輸液，以避免組織壞死和（或）血酸靜脈炎。 16輸液的副總裁會引起性低血壓，它會促使孩子說謊，緩慢的速度靜脈滴注。
1 材料和方法
1.1 臨床樣本收集
種植體周圍炎的骨組織樣本來自中國總醫(yī)院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區(qū)且因種植體周圍炎出現(xiàn)種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來源的樣本來自中國總醫(yī)院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術(shù)患者，夾取舌側(cè)骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質(zhì)疏松癥等全身系統(tǒng)性疾病。本研究已經(jīng)中國總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且每例患者均簽署了知情同意書。
1.2 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化
PBS反復(fù)沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國），吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，待鋪皿80%進(jìn)行傳代。采用反復(fù)貼壁法[3]對細(xì)胞進(jìn)行純化。
1.3 堿性磷酸酶鑒定染色
將第3代分離純化后的成骨細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于24孔板，細(xì)胞達(dá)70%時(shí)，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復(fù)沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國）染色1 h。PBS反復(fù)沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)觀察及照相。
1.4 MTT法檢測成骨細(xì)胞的增殖能力
取對數(shù)生長期第3代細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細(xì)胞混懸液，調(diào)整密度為2×104個(gè)·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%
CO2[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.6 Western blot法檢測成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)
取第3代細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞用0.01 mol·L-1 PBS反復(fù)沖洗3遍，裂解細(xì)胞提取蛋白。取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國）（1︰1 000稀釋）和β-actin（1︰2 000稀釋），37 ℃孵育2 h，洗膜后，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國）（1︰4 000稀釋）孵育50 min，化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物，X線片顯影并定影，所有雜交信號經(jīng)成像分析儀系統(tǒng)測定條帶密度進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白的表達(dá)水平。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2 結(jié)果
2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化
種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞與正常組織來源的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)過程中狀態(tài)基本相同，10～14 d時(shí)從組織塊中爬出，形狀多為不規(guī)則形和三角形（圖1）。反復(fù)貼壁法純化成骨細(xì)胞貼壁后，2種來源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯差異，細(xì)胞均呈長梭形和多邊形，胞核可見多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。
2.2 堿性磷酸酶鑒定染色
細(xì)胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進(jìn)行檢測，可見藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來源細(xì)胞都表現(xiàn)出了堿性磷酸酶陽性，但正常組織來源的成骨細(xì)胞比種植體周圍炎來源成骨細(xì)胞內(nèi)可見更多染色顆粒。
2.3 2種來源的成骨細(xì)胞增殖能力的比較
MTT檢測結(jié)果（圖4）表明，正常組織來源與種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞都表現(xiàn)出了一定的體外擴(kuò)增能力，從第4天起2種來源細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。
2.5 2種來源的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較
Western blot檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d時(shí)，與正常組織來源的成骨細(xì)胞相比，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)降低，相對灰度值分析表明種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)水平約為正常組織來源的1/3（P<0.05）（圖6）。
3 討論
骨結(jié)合是牙種植手術(shù)的基礎(chǔ)。種植體與頜骨骨性結(jié)合面的形成與種植區(qū)的骨密度密切相關(guān)，骨密度越高，種植體與骨的結(jié)合率就越高[4]。種植體周圍炎正是在炎性微環(huán)境下，破壞了種植體與頜骨的骨結(jié)合，從而使種植體周圍支撐骨組織的功能喪失。成骨細(xì)胞在骨組織的修復(fù)和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]的主要細(xì)胞；因此，研究炎癥組織來源的成骨細(xì)胞很有意義。
本研究從種植體周圍炎種植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來源的成骨細(xì)胞，通過比較炎癥組織來源的成骨細(xì)胞和正常組織來源的成骨細(xì)胞的增殖能力以及相關(guān)骨組織修復(fù)基因的表達(dá)等生物學(xué)功能變化，探討炎性微環(huán)境對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
本實(shí)驗(yàn)選用的成骨細(xì)胞均為第4代以內(nèi)的細(xì)胞，結(jié)果表明，炎癥組織來源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)后仍然具有一定的炎癥組織來源特異性。炎性細(xì)胞因子和種植體周圍炎致病菌的毒力因子會導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖能力顯著 下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)上并沒有表現(xiàn)出和正常組織來源的成骨細(xì)胞有明顯差異，但是在細(xì)胞增殖活力方面表現(xiàn)出了不同，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力整體低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。筆者認(rèn)為這是由于種植體周圍炎的炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo)，Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨組織的形成與重建過程中具有重要的作用[5]。炎性因子會影響Runx2的表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細(xì)胞分化成骨的重要基質(zhì)。研究[8]表明，種植體周圍炎的齦溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結(jié)果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的Runx2和Col Ⅰ表達(dá)水平相比正常組織來源顯著下降，表明炎性微環(huán)境可影響成骨細(xì)胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達(dá)，這與Liu等[9]對干細(xì)胞的研究結(jié)果一致。
OCN與成骨細(xì)胞的礦化緊密相關(guān)，在一定程度上反應(yīng)了成骨細(xì)胞礦化的能力。學(xué)者[10]研究證實(shí)炎性微環(huán)境會降低[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達(dá)。本研究中，種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN mRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致OCN蛋白水平也明顯降低。可見炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞礦化的能力。
人非小細(xì)胞肺癌NC-H446細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞室提供，我院實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室保存。
1.3 主要儀器
美國SHELLAB2300型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；日本Nikon倒置相差顯微鏡；美國Sfat自動(dòng)酶標(biāo)分析儀；美國FACScan流式細(xì)胞儀等。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 肺康飲含藥血清的制備
1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)
1.4.4 肺康飲含藥血清對NC-H446細(xì)胞增殖的影響
抑制率（%）=（1- OD實(shí)驗(yàn)組/ OD對照組）×100%
1.4.5 肺康飲含藥血清誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡表達(dá)的測定
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用多因素方差分析法檢測組間差異的顯著性。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。
2 結(jié)果
2.1 肺康飲含藥血清對NC-H446細(xì)胞增殖的影響
2.2 肺康飲含藥血清對NC-H446細(xì)胞凋亡的影響
3 討論
1治療現(xiàn)況
中醫(yī)對本病的病機(jī)尚未有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，臨床治療多辨證使用益氣活血，養(yǎng)陰清熱，健脾祛濕，溫經(jīng)通絡(luò)，補(bǔ)益肝腎，溫陽散寒，活血化瘀，或配合中藥外洗外敷等方法，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為瘀血內(nèi)阻是本病的基本因素。因此，活血化瘀應(yīng)貫穿疾病始終，臨床上也多以活血化瘀方劑為主，療效確定。西醫(yī)治療方法主要有藥物治療、手術(shù)治療、介入治療。藥物治療包括抗栓和擴(kuò)張血管治療，積極的治療高血壓、高血脂，防治動(dòng)脈硬化，穩(wěn)定斑塊，防止斑塊破裂。手術(shù)治療主要指重建肢體血運(yùn)，包括動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、血管旁路移植術(shù)和血管腔內(nèi)治療術(shù)；ASO的介入治療仍局限于短段病變，短段主髂動(dòng)脈病變的球囊擴(kuò)張和支架置入術(shù)效果較好；此外，隨著狹窄的逐漸形成，肢體的側(cè)支循環(huán)隨之逐漸建立[3]，使得一些醫(yī)家逐漸注意到利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等誘導(dǎo)血管生成的基因治療。
2補(bǔ)腎與動(dòng)脈硬化性閉塞癥關(guān)系
動(dòng)脈硬化性閉塞癥多見于中老年患者，人到中年以后，腎中精氣逐漸減少，出現(xiàn)腎虛。腎陰虛則臟腑百脈、形體器官失充，血液凝澀，脈絡(luò)失養(yǎng)，則患者表現(xiàn)為肢端色黑壞死破潰，劇痛，夜不能眠，肢端潮紅或暗紅，肢體肌肉明顯萎縮，皮膚干皺、口渴、便秘、溲赤，發(fā)熱；腎陽虛則陽氣虧虛無力推動(dòng)、溫煦氣血以榮四末，致血行遲緩不暢而瘀，則指（趾）端壞疽或潰瘍、四肢發(fā)涼，患處皮膚溫度較低，膚色蒼白，脈搏減弱或消失等。筆者認(rèn)為腎虛是造成本病血脈閉塞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在治療本病中補(bǔ)腎也起著關(guān)鍵的作用，鹿茸性甘、咸、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒之功效，鹿茸對動(dòng)脈硬化閉塞癥的防治作用主要有以下幾點(diǎn)。
2.1鹿茸可促進(jìn)血液生成和血行中醫(yī)認(rèn)為，鹿茸可使人體腎精充盛，防止衰老，壯腎陽，腎陽可促進(jìn)機(jī)體的溫煦、運(yùn)動(dòng)興奮和化氣功能，使氣的運(yùn)動(dòng)加快，則血的輸布運(yùn)行也加快，氣化加快則產(chǎn)熱增加，使溫煦作用加強(qiáng)，使陽虛患者患肢血脈得到溫養(yǎng)而減輕病情。鹿茸還可益精血，強(qiáng)筋骨，為血肉有情之品，使動(dòng)脈硬化性閉塞癥患者患肢血液充足，血脈得到濡養(yǎng)，有助血行。李召[4]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸對正常及白血病骨髓與人骨髓單個(gè)核細(xì)胞有促增殖作用，能促進(jìn)骨髓造血，而且鹿茸有抑制紅細(xì)胞凝集和促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用[5]。
2.2鹿茸可促進(jìn)血管新生鹿茸在治療動(dòng)脈硬化性閉塞證中還和促進(jìn)血管新生有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)溫陽藥物鹿茸能促進(jìn)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性，而骨髓是一個(gè)天然的細(xì)胞生長因子庫，在其生長過程中，成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞的生長同步進(jìn)行[6]，血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）主要存在于骨髓。何秀娟等[7]發(fā)現(xiàn)鹿茸能促進(jìn)離體人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，提示在體內(nèi)可能促進(jìn)EPCs的增殖，促進(jìn)血管生成。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是成年個(gè)體中與血管新生關(guān)系最為緊密的干細(xì)胞成分，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，EPCs的增殖、趨化、分化，參與新生血管的形成，它可以被細(xì)胞因子或者來自于外周血中的血管生長因子信號動(dòng)員到外周循環(huán)而進(jìn)入外周血管組織中，通過整合到血管壁或提供生長因子兩種方式來促使新生血管的形成[8]，新生的血管為缺血部位提供氧、營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)缺血部位血管新生，改善缺血狀態(tài)。中醫(yī)認(rèn)為腎主骨生髓，骨者，髓之府，因此，補(bǔ)腎可生髓，從這點(diǎn)也提示了鹿茸可以促進(jìn)骨髓增殖。血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞對組織缺血有反應(yīng)，人外周血中培養(yǎng)擴(kuò)增的EPCs，在肢體缺血的動(dòng)物體內(nèi)，能夠特異性地向缺血部位趨化，參與血管生成，增加毛細(xì)血管數(shù)量，具有改善組織血流的治療作用。向缺血部位趨化的具體機(jī)制還不清楚，可能與缺血所造成的局部低氧血癥、缺血組織釋放的某些細(xì)胞因子和炎性因子，對這些細(xì)胞的趨化可能發(fā)揮了一定作用[9]。
2.3鹿茸可促進(jìn)瘡口愈合中醫(yī)認(rèn)為鹿茸有托瘡毒之效，可用于瘡瘍久潰不斂，或陰疽內(nèi)陷不起，可溫補(bǔ)精血，托毒外出和生肌之效，對于動(dòng)脈硬化閉塞癥后期出現(xiàn)的破潰反復(fù)難愈有托毒和生肌之功，可促進(jìn)瘡口愈合?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，馬鹿茸多肽通過促進(jìn)表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖加速皮膚創(chuàng)傷愈合[10]。
3小結(jié)
鹿茸性甘、咸、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨之功效，可用于腎陽不足、精血虧虛、筋骨無力之癥，為補(bǔ)腎之良藥。這從傳統(tǒng)理論方面提示了鹿茸具有促造血，緩解肢體不適之功效，筆者在臨床中也遇到此病患者甚多，常給予芪芍復(fù)脈湯[鹿茸2g（研末沖服），黃芪30g，白芍18g，桂枝10g，當(dāng)歸15g，麥冬15g，玄參15g，川芎10g，全蝎10g，川牛膝15g，土元10g，烏藥10g，丹參30g，三七粉3g，阿膠6g，甘草6g]，隨癥辨證加減，意在用芪芍復(fù)脈湯益氣活血，滋陰復(fù)脈，加鹿茸意在溫補(bǔ)腎陽，又補(bǔ)益精血，強(qiáng)筋骨，恢復(fù)陽氣溫煦推動(dòng)之力，使精血充盛，臨床應(yīng)用，效果顯著，而且許多患者在病情好轉(zhuǎn)的同時(shí)病變部位血管彩超發(fā)現(xiàn)新生血管且血流通暢。
現(xiàn)代研究認(rèn)為鹿茸多肽既對表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有顯著的促進(jìn)增殖作用，加速創(chuàng)面愈合的質(zhì)量和速度，又可促進(jìn)血液運(yùn)行，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化和遷移，促進(jìn)病變部位血管生成，這些都表明鹿茸對動(dòng)脈硬化性閉塞癥的防治有著積極的作用，加之中醫(yī)認(rèn)為鹿茸乃血肉有情之品，可以補(bǔ)腎填精，由以上可以推斷，鹿茸骨髓EPCs促進(jìn)血管新生，鹿茸是否還具有把EPCs動(dòng)員到外周缺血組織的作用，是否需要益氣活血類藥物來促進(jìn)它的轉(zhuǎn)移，這些還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床觀察，但這一發(fā)現(xiàn)對缺血性疾病的治療提供了一個(gè)新思路。董蔚等[9]在體外擴(kuò)增EPCs的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了EPCs在動(dòng)物體內(nèi)促血管生成的作用，EPCs可特異性地分布在缺血肢體的血管結(jié)構(gòu)中，缺血部位的側(cè)支循環(huán)形成和毛細(xì)血管新生可能與外源性血管生長因子、基因或內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)入組織中有關(guān)，我們可以發(fā)現(xiàn)和利用一些藥物或生長因子促進(jìn)EPCs表達(dá)、促進(jìn)EPCs從骨髓向外周動(dòng)員，提高循環(huán)中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，或通過移植體外擴(kuò)增的EPCs來增強(qiáng)缺血組織的血管再生，從而促進(jìn)新生血管的形成。鹿茸在治療動(dòng)脈硬化性閉塞癥中起著重要的作用，隨著對其作用機(jī)制的深入研究，很有可能尋找到治療ASO的有效途徑。
參考文獻(xiàn)：
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【正文快照】：
石墨烯(Graphene)是一類單原子層二維原子晶體,于2004年首次從石墨中分離獲得[1],其豐富而優(yōu)異的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)性能[2]使其成為近年來納米材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。氧化石墨烯(Grapheneoxide,GO)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多的石墨烯衍生物之一,運(yùn)用Hummer方法[3],由石墨經(jīng)化學(xué)氧化
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【參考文獻(xiàn)】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條
1 馮翠霞;張艷;林麗玲;張彩虹;陳劍剛;;高效液相色譜法測定尿中馬尿酸、甲基馬尿酸三種同分異構(gòu)體[J];廣東化工;2010年07期
目的研究蒼術(shù)揮發(fā)油對成骨樣細(xì)胞UMR-106的增殖作用。方法蒼術(shù)揮發(fā)油和UMR106 成骨樣細(xì)胞體外共同培養(yǎng)，用MTT 法檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果揮發(fā)油在0.001 mg/ml 培養(yǎng)48h具有最強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。結(jié)論蒼術(shù)揮發(fā)油中可能含有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的活性成分。
【關(guān)鍵詞】 蒼術(shù)揮發(fā)油 增殖作用 成骨樣細(xì)胞UMR－106 MTT 法
Abstract：ObjectiveTo research the proliferative effects of essential oil in Atractylodes lancea on osteoblast - UMR-106 cells .MethodsOsteoblasts－UMR-106 cells were cultured with essential oil of Atractylodes in vitro，and MTT method was used to detect the cell proliferation. ResultsEssential oil of Atractylodes lancea at a concentration of 0.001 mg/ml， within 48 h ，strongly stimulated the proliferation of UMR-106 cells.ConclusionEssential oil of Atractylodes lancea probably has some chemical compositions which can stimulate the proliferation of UMR-106 cells.
Key words：Essential oil in Atractylodes lancea; Proliferation effect; UMR-106 cell; MTT method
蒼術(shù)（Rhizoma atratylodes）為菊科植物南蒼術(shù)Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根莖。蒼術(shù)性辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目作用。主治脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒、感冒等［1］。
蒼術(shù)在中醫(yī)臨床中使用十分廣泛。已有研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)揮發(fā)油增加去卵巢雌性大鼠的骨鈣含量（閆雪生《蒼術(shù)油軟膠囊的研制》。山東中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文，2002），但對蒼術(shù)揮發(fā)油是否影響成骨細(xì)胞的增殖，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究蒼術(shù)揮發(fā)油對成骨細(xì)胞UMR-106的增殖作用。
1 材料與方法
1.1 材料
蒼術(shù)藥材購自上海德康藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室黃寶康副教授鑒定為蒼術(shù)Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根莖。
1.2 試劑
DMEM 培養(yǎng)基(Cibco)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氫溴酸鹽MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 方法
1.3.1 揮發(fā)油樣品的制備水蒸氣蒸餾法：將藥材樣品粉碎過40目篩，精確稱取200 g的蒼術(shù)，加水浸泡1 h，然后用揮發(fā)油提取器按常規(guī)水蒸氣蒸餾，提取直至揮發(fā)油的量不再增加，蒸餾液用正己烷萃取，萃取液用無水硫酸鈉干燥，過濾，微熱蒸去溶劑得揮發(fā)油樣品，揮發(fā)油樣品為淡黃色透明油狀物，具有刺激性氣味。取50 mg揮發(fā)油樣品溶于1 ml二甲基亞砜中，用滅菌過的0.2 mm 濾器( Gelmann Sciences) 除菌，并于4℃保存，備用。臨用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。
1.3.2 成骨樣細(xì)胞UMR－106的培養(yǎng)［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤細(xì)胞系) 細(xì)胞株獲贈(zèng)于江蘇鎮(zhèn)江醫(yī)學(xué)院病原生物教研室，源于美國麻省醫(yī)學(xué)院。將UMR-106細(xì)胞培養(yǎng)于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml鏈霉素）的無菌DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，2～3 d換液1次。
1.3.3 MTT 法測定細(xì)胞的增殖［2］取對數(shù)生長期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，用含血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度稀釋至1×105個(gè)/ml ，鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μl/孔)培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度揮發(fā)油(每個(gè)濃度6孔)的無血清DMEM培養(yǎng)。結(jié)束培養(yǎng)4 h前棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml，用PBS配制)繼續(xù)孵育4 h，有藍(lán)紫色沉淀生成，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO) ，振蕩10 min待沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀以550 nm 為測定波長、650 nm為參比波長測定吸光值，以不加中藥的細(xì)胞孔測得的吸光值為空白，用t檢驗(yàn)進(jìn)行各加藥組與空白組之間均值的比較。細(xì)胞增殖率的計(jì)算如下：
增殖率（%）= Ai實(shí)驗(yàn)組- Ao對照組Ao對照組×100%
Ai：不同條件下的吸光值；Ao：空白組的吸光值
2 結(jié)果
2.1 MTT 法測定細(xì)胞增殖與吸光度的關(guān)系將UMR-106細(xì)胞分別以6個(gè)不同濃度(1×105～1.2×106個(gè))鋪入96 孔板，培養(yǎng)8 h貼壁后，用上述方法測定每孔吸光度(Y)，與細(xì)胞數(shù)目(X)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0，n=6)，兩者具有良好的線性關(guān)系。見圖1。
2.2 揮發(fā)油對細(xì)胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4種濃度的揮發(fā)油作用于細(xì)胞24 h，在λ＝550 nm測定其吸光值。結(jié)果見表1 。表1 不同揮發(fā)油濃度對UMR-106的增殖作用(略)
蒼術(shù)揮發(fā)油濃度0.001 mg/ml時(shí)培養(yǎng)24 h，可明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖，細(xì)胞的增殖率為10.44%。在低的濃度下對細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用，表明揮發(fā)油短期內(nèi)使用低濃度較好。
為了觀察揮發(fā)油促細(xì)胞增殖的最適宜的作用時(shí)間，用濃度為0.001 mg/ml的蒼術(shù)揮發(fā)油作用于細(xì)胞分別為24，48，72 h ， 在λ＝550 nm測定其吸光值。結(jié)果見表2。表2 不同作用時(shí)間對細(xì)胞增殖的影響(略)
由表2可見，當(dāng)揮發(fā)油在濃度為0.001 mg/ml作用24 h時(shí)能明顯刺激UMR-106增殖，在近48 h時(shí)增殖率為20.96％， 達(dá)到最強(qiáng)，72 h 時(shí)細(xì)胞數(shù)目又下降。
3 討論
蒼術(shù)揮發(fā)油在0.001 mg/ml濃度下作用24，48 h，均對UMR-106增殖有明顯的促進(jìn)作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤細(xì)胞系從形態(tài)和性質(zhì)上都保留了成骨細(xì)胞獨(dú)有的特征， 并且具有穩(wěn)定、均一、純度高等優(yōu)點(diǎn)。 因此，UMR-106 細(xì)胞作為一種國際公認(rèn)的成骨細(xì)胞系可以用來代替成骨細(xì)胞［3］。在骨形成最初階段的成骨細(xì)胞增殖期， 成骨細(xì)胞數(shù)量增多， 形成多層細(xì)胞并合成、分泌I型膠原以便最終礦化形成骨結(jié)節(jié)。成骨樣細(xì)胞的增殖與細(xì)胞培養(yǎng)液中藥物的成分有關(guān)， 與成骨樣細(xì)胞UMR-106共同體外培養(yǎng)的方法可能作為對骨形成有促進(jìn)作用的活性化合物的篩選模型， 經(jīng)過進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從這些活性藥物中追蹤對骨形成有促進(jìn)作用的活性成分。因此，以成骨樣細(xì)胞UMR-106 的增殖為活性指標(biāo)，觀察了蒼術(shù)揮發(fā)油對該細(xì)胞系增殖的作用。由于采用的是蒼術(shù)揮發(fā)油和細(xì)胞共同體外培養(yǎng)的方法，推測蒼術(shù)揮發(fā)油中含有直接刺激成骨樣細(xì)胞增殖的成分，為蒼術(shù)治療骨質(zhì)疏松癥提供初步篩選，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【參考文獻(xiàn)】
Effect of CD24 on cell proliferation capability in melanoma cells
LI Ming, LI Yan, CHEN Wei-qiang, et al.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical College, Guangdong 510006, China
【Abstract】 Objective To study the effect of CD24 on the proliferation ability of melanoma cells. Methods B16F10 cells were transfect with pSi-CD24, a siRNA plasmid target to CD24. Then the expression of CD24 was measured by RT-PCR and Western blot and the cell proliferation was assessed by MTT assay. Results CD24 expression was obviously down-regulated by pSi-CD24, and knockdown CD24 can effectively inhibited the proliferation of melanoma cells. Conclusion CD24 can enhance the proliferation of melanoma cells in vitro, which indicated CD24 play an important role in tumor growth.
【Key words】 CD24; Tumor; Proliferation
CD24是一種低分子量高度糖基化的蛋白質(zhì)粘附分子，作為P-選擇素的配體之一，CD24參與介導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板之間的粘附。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)CD24高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，并且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)［1］。對于其作用機(jī)制，以往研究較多的集中的CD24與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系上，而CD24在腫瘤增殖中的作用研究尚不十分明確。因此，本實(shí)驗(yàn)用siRNA干擾CD24的表達(dá)，觀察抑制CD24表達(dá)對細(xì)胞的增殖的影響，初步探討CD24在腫瘤生長中的作用。
1 資料與方法
1.1 試劑與儀器 引物、分子量Marker和質(zhì)粒提取試劑盒(大連TaKaRa公司)；兩步法RT-PCR試劑盒、Trizol 、Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen 公司)；抗CD24 抗體和抗β-actin抗體(美國Santa Cruze公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)； 蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。人黑色素瘤細(xì)胞株B16F10為本室保存。靶向CD24的siRNA干擾質(zhì)粒pSi-CD24由本室構(gòu)建，按試劑盒說明書提取備用［2］。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的人黑色素瘤細(xì)胞B16F10細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，按照說明書用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對照組和pSi-CD24組。
1.2.2 B16F10細(xì)胞中CD24 mRNA表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染24 h
后，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照說明書以O(shè)ligo-d(T)18為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用特異性引物擴(kuò)增CD24和β-Actin。引物序列和擴(kuò)增方法見本課題組前期發(fā)表的論文［2］。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，拍照，觀察。
1.2.3 B16F10細(xì)胞中CD24蛋白表達(dá)的變化 轉(zhuǎn)染48 h后按照試劑盒操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5 %的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗CD24(1∶1000)或抗β-Actin(1∶1000)單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶3000) 37℃孵育1 h，ECL法顯影，常規(guī)洗片拍照。
1.2.4 pSi-CD24對B16F10細(xì)胞增殖的影響 取空白對照組和pSi-CD24組細(xì)胞細(xì)胞，接種至96孔板上，各組設(shè)4孔，在轉(zhuǎn)染后0、24、48和72 h后加入MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，并繪制細(xì)胞生長曲線。
2 結(jié)果
2.1 pSi-CD24對CD24 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在正常情況下，黑色素瘤細(xì)胞B16F10高表達(dá)CD24，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSi-CD24后，B16F10細(xì)胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯降低，說明重組質(zhì)粒pSi-CD24能抑制CD24的表達(dá)。結(jié)果見圖1。
2.2 pSi-CD24對B16F10細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pSi-CD24質(zhì)粒后，黑色素瘤細(xì)胞B16F10的增值明顯被抑制，在48 h和72 h與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。
3 討論
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種簡單有效的基因沉默工具，主要通過誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于基因治療和功能基因組學(xué)的研究中［3］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi研究中，通過質(zhì)粒等表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄形成siRNA具有經(jīng)濟(jì)和容易操作、作用持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，是目前siRNA最常用的方法。我們前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的pSilencer 3.1載體，成功構(gòu)建了靶向CD24基因的表達(dá)載體pSi-CD24［2］。本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR和Western blot在黑色素瘤細(xì)胞B16F10中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pSi-CD24質(zhì)粒后細(xì)胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)較對照組均有明顯降低，說明pSi-CD24可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)siRNA, 高效特異地抑制CD24的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CD24基因的功能和以CD24為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。
作為P-選擇素的配體，CD24高表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下CD24和P-選擇素介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與結(jié)合，腫瘤細(xì)胞與血小板結(jié)合后，形成血小板血栓，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，降低免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷效應(yīng)；腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附則有助于腫瘤細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到組織中形成轉(zhuǎn)移灶，因此，CD24/P-選擇素的結(jié)合被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。還有研究證實(shí)CD24也介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與纖維粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620細(xì)胞的粘附能力［5］。CD24對腫瘤的生長也具有調(diào)控作用，Smith等發(fā)現(xiàn)敲除CD24基因?qū)е履[瘤細(xì)胞凋亡增加［6］。有學(xué)者認(rèn)為這與CD24能促進(jìn)腫瘤微血管形成有關(guān)，也有研究認(rèn)為與CD24促腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)敲除黑色素瘤B16F10細(xì)胞CD24基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制CD24表達(dá)可以降低細(xì)胞的增值能力，說明CD24可能通過某些信號途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。
綜上所述，CD24在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的生長、粘附和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制CD24表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻礙腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此CD24可能是一個(gè)治療腫瘤的新靶點(diǎn)，但對其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。
參 考 文 獻(xiàn)
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軟骨缺損是骨科臨床十分常見的疾病，但目前卻尚無有效的治療方法，無論是軟骨的自體移植、同種異體移植、異體移植都無法滿足整形外科及關(guān)節(jié)外科對軟骨修復(fù)的需要。軟骨組織工程的發(fā)展，為臨床治療軟骨缺損提供了新的方法，其創(chuàng)造的人工軟骨將是治療軟骨缺損的理想材料。
多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSc)具有來源廣泛、體外培養(yǎng)時(shí)增殖分化能力強(qiáng)、在特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)調(diào)控下向軟骨分化等特點(diǎn)，被認(rèn)為是組織工程化軟骨中最理想的種子細(xì)胞。國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過多年探索，對BMSC的分化調(diào)控有了更深入研究。同時(shí)，隨著中藥研究水平的深入，中藥通過誘導(dǎo)BMSC作用于軟骨組織工程已有了的進(jìn)一步的發(fā)展，現(xiàn)將情況總結(jié)如下：
1中藥誘導(dǎo)BMSc增值及向軟骨分化研究
1.1中藥促進(jìn)BMSc的增值
BMSC具有數(shù)量少、可自動(dòng)分化等特點(diǎn)，不易控制其分化方向，過去研究證明中藥可以對其增殖分化產(chǎn)生影響。柳海峰[1] 研究表明，補(bǔ)腎益骨湯提取物對體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用。人參皂苷Rg1可以促進(jìn)豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖分化，因?yàn)槿藚⒃碥誖g1能夠促進(jìn)DNA的合成，促使細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。舒曉春[2]骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)兔BMSCs增殖。
1.2中藥誘導(dǎo)BMSC向軟骨分化
中藥及中藥復(fù)方提取物是通過多途徑、多靶點(diǎn)誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化，并具有毒副作用小、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向軟骨分化過多地使用化學(xué)制劑作誘導(dǎo)劑，有一定毒性或有較大副作用，應(yīng)用于人體內(nèi)可能存在不安全因素。國內(nèi)研究者多從補(bǔ)肝腎、壯筋骨的中藥或中藥復(fù)方著手尋找安全、有效的中藥誘導(dǎo)劑。
肖魯偉[3]、李楠[4]龜鹿二仙膠湯含藥血清、右歸飲可以有效地誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞。吳政安[5]消痹靈中藥復(fù)方劑體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)率與使用地塞米松、維生素、TGF誘導(dǎo)培養(yǎng)體系無明顯差別。吳險(xiǎn)峰[6]茶黃素在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中與TGF-β1有協(xié)同作用促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，聯(lián)合作用優(yōu)于單純TGF-β1。修忠標(biāo)[7]鹿茸多肽對MSCs軟骨細(xì)胞分化生物學(xué)行為的影響過程中與TGF一βl相似，在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可促進(jìn)Ⅱ型膠原與GAG的表達(dá)。并且通過抑制Caspase-3mRNA表達(dá)及其蛋白酶活性以阻止或逆轉(zhuǎn)軟骨表型化MSCs凋亡。李明波[8]透骨消痛顆粒促進(jìn)BMSC向軟骨分化過程中Sox9因子的表達(dá)，并抑制Cbfal因子的表達(dá)，在一定程度上抑制其終末化，延緩軟骨退變的過程。
總的來說，中藥或中藥復(fù)方提取物誘導(dǎo)BMSC向軟骨分化可能與藥物增加Sox9、TGF－β的合成及某些受體的數(shù)量，起到促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成，從而定向分化為軟骨細(xì)胞。
2中藥在軟骨組織工程中的應(yīng)用
目前組織工程學(xué)應(yīng)用在臨床上已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)新的階段，四六三醫(yī)院[9-10]利用自體細(xì)胞注射治療股骨頭壞死，通過將患者骨髓干細(xì)胞的體外擴(kuò)增并進(jìn)行自體干細(xì)胞灌注，先后治療55例酒精性股骨頭壞死、122例缺血性股骨頭壞死。研究提示，自體骨髓干細(xì)胞體外擴(kuò)增的手段既解決異體移植的免疫排斥，同時(shí)避免種子細(xì)胞來源短缺等問題，誘導(dǎo)自體骨髓干細(xì)胞向軟骨分化將是解決骨科中軟骨缺損的希望。
中藥已廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)的研究。例如：中藥提取物制作成骨組織工程誘導(dǎo)修復(fù)材料―羊藿苷殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合材料[11]，具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)活性，能有效填充骨缺損并促進(jìn)早期成骨，是一種理想的骨組織工程誘導(dǎo)修復(fù)材料。中藥雙黃[12]能促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖，為牙周組織工程的種子細(xì)胞提供了體外增值擴(kuò)增的新方法。中藥生肌液[13]能修復(fù)兔皮膚缺損，能夠有效擴(kuò)展皮膚缺損處的覆蓋面積，縮短皮膚缺損的愈合時(shí)間。
目前，中藥作用于軟骨組織工程的研究還相對較少，主要通過中藥灌胃配合BMSC復(fù)合體移植治療軟骨缺損、中藥提取物體外對軟骨器官或軟骨細(xì)胞的促進(jìn)作用這兩方面來考察中藥修復(fù)軟骨缺損效果的機(jī)制。如羊藿[14]中藥提取物能夠在體外促進(jìn)軟骨器官生長和細(xì)胞增殖，七葉亭[15]灌胃修復(fù)兔骨關(guān)節(jié)軟骨缺損、獨(dú)活寄生湯結(jié)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合體修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損等等。此外，張猛[16]對藻酸鈉載體復(fù)合軟骨細(xì)胞在黃茂甲昔作用下成軟骨作用及機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性研究、金翔[17]對威靈仙干預(yù)可注射性C/β-GP凝膠復(fù)合同種異體軟骨細(xì)胞體外三維培養(yǎng)及修復(fù)軟骨缺損進(jìn)行了研究。在尋找合適BMSC軟骨分化的三維立體材料過程中，中藥制劑學(xué)在組織工程中越來越受到了的重視，研究與應(yīng)用將越來越廣泛。
3展望
中醫(yī)藥文化是我國的文化寶藏，中醫(yī)辨證施治可以顯著減緩或抑制早期膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨退變、減少關(guān)節(jié)滑液分泌、在軟骨破壞區(qū)出現(xiàn)大量幼稚軟骨細(xì)胞，減輕膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[18]。中藥如：骨碎補(bǔ)[19]、羊藿、秦皮、威靈仙、龜板等，中藥復(fù)方如：獨(dú)活寄生湯[20]、補(bǔ)腎健腰合劑[21]、復(fù)元膠囊[22]、腰痛舒膠囊[23]、強(qiáng)肌健力飲[24]等，都能保護(hù)軟骨細(xì)胞、有效促進(jìn)軟骨的修復(fù)，治療關(guān)節(jié)炎等作用。
目前存在的主要問題是中藥誘導(dǎo)劑的研究層面停留在體外對BMSC的軟骨分化效應(yīng)上，而對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的再生修復(fù)機(jī)理上不完全明了。而中藥成分復(fù)雜，如何精確調(diào)控BMSc向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為研究難點(diǎn)。中藥誘導(dǎo)劑的研究目前處于起步階段，國內(nèi)的相關(guān)文獻(xiàn)較少，有待學(xué)者們進(jìn)一步研究，但相信在不久將來，中藥誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化的作用途徑和機(jī)制，能從分子細(xì)胞水平上得到進(jìn)一步的闡釋，更快地用于指導(dǎo)臨床治療工作。
參考文獻(xiàn)
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[摘要] 多發(fā)性骨髓瘤（MM）屬于一種血液系統(tǒng)腫瘤，基因染色體的突變、MM瘤細(xì)胞和骨髓微環(huán)境的交流等均在其發(fā)病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近年來，臨床治療MM的熱點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)閷M和骨髓微環(huán)境關(guān)系進(jìn)行深入的研究，對各條異常活化的信號通路進(jìn)行有針對性的治療過程中運(yùn)用靶向藥物。該研究首先概述了骨髓微環(huán)境在MM 發(fā)病機(jī)制中的作用，然后從沙利度胺及其衍生物、蛋白酶體抑制劑、免疫治療與分子生物學(xué)治療三個(gè)方面對骨髓微環(huán)境在多發(fā)性骨髓瘤靶向治療近況進(jìn)行了分析探討。
關(guān)鍵詞 骨髓微環(huán)境；多發(fā)性骨髓瘤（MM）；發(fā)病機(jī)制；作用；靶向治療近況
[中圖分類號] R738 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）07（c）－0197-02
[作者簡介] 董進(jìn)梅（1973-），女，彝族，云南普洱人，本科，副主任醫(yī)師。
骨髓微環(huán)境中各種成分能夠促進(jìn)MM瘤細(xì)胞的生存、增殖等，其途徑是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常活化。目前，臨床關(guān)注的焦點(diǎn)是對MM在骨髓中的發(fā)病機(jī)制有一個(gè)清晰的認(rèn)識，促進(jìn)靶向治療針對性的顯著提升及藥物對MM細(xì)胞毒性的顯著增強(qiáng)，對耐藥進(jìn)行有效的防止，對患者的預(yù)后進(jìn)行切實(shí)有效的改善等。該文現(xiàn)就骨髓微環(huán)境在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及靶向治療近況作如下綜述。
1 骨髓微環(huán)境在MM 發(fā)病機(jī)制中的作用
MM能夠促進(jìn)IL-6的旁分泌，具體機(jī)制為通過黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，也就是黏附骨髓基質(zhì)細(xì)胞，而IL-6又能夠進(jìn)一步促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖及存活，并對其進(jìn)行有效的維持。Chatterjee等醫(yī)學(xué)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，人MM細(xì)胞的存活在存在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的情況下不會對IL-6 /gp130 / Stat3信號通路進(jìn)行以來。同時(shí)證實(shí)，MM的發(fā)生和發(fā)展有黏附分子異常表達(dá)的參與，我們可以從以下兩個(gè)方面看黏附分子異常表達(dá)對MM發(fā)病機(jī)制的影響：①促進(jìn)骨髓瘤前提細(xì)胞的歸巢；②促進(jìn)破骨細(xì)胞激活因子及骨髓瘤細(xì)胞生長因子的產(chǎn)生。MM細(xì)胞的歸巢的介導(dǎo)因素為CD44、ICMA-1、MPC-1 (CD11b)、VLA-4、VLA-5等[1]。MM結(jié)合基質(zhì)蛋白及黏附基質(zhì)細(xì)胞的情況下均會在極大程度上調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的生長，具體機(jī)制為通過syndecan- 1和N 型膠原、VLA-4和纖連蛋白的作用及VLA-4（位于MM細(xì)胞表面）結(jié)合VCVM-1（屬于基質(zhì)細(xì)胞）。MM細(xì)胞的生長和生存可以在syndecan -1黏附機(jī)制下得到極大的發(fā)展，對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) -1進(jìn)行誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生，從而為骨的吸收及腫瘤的浸潤提供良好的前提條件。P27及其他相關(guān)基因表達(dá)水平會在MM細(xì)胞黏附纖連蛋白的情況下上升，進(jìn)而對細(xì)胞耐藥進(jìn)行介導(dǎo)。IL-6的轉(zhuǎn)錄及分泌一方面會在MM黏附基質(zhì)細(xì)胞的作用下發(fā)生重大改變，另一方面還會在MM細(xì)胞本身分泌VEGF等的作用下發(fā)生重大改變，而IL-6的轉(zhuǎn)錄和分泌以來基質(zhì)細(xì)胞NF-JB[2]。
2 骨髓微環(huán)境在多發(fā)性骨髓瘤靶向治療近況
2.1 沙利度胺及其衍生物
2.1.1 沙利度胺 20世紀(jì)50年代，沙利度胺首次進(jìn)入歐洲市場。沙利度胺屬于一種鎮(zhèn)靜劑，曾經(jīng)在孕婦妊娠嘔吐的治療中得到了一定的應(yīng)用，但是由于其會引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如胎兒畸形等，因此逐漸退出了市場[3]。Singhal等醫(yī)學(xué)學(xué)者在1999年對沙利度胺在復(fù)發(fā)及難治性多發(fā)性骨髓瘤中的良好臨床療效進(jìn)行了首次報(bào)道，發(fā)現(xiàn)沙利度胺將其抗腫瘤作用發(fā)揮出來的具體機(jī)制可以從以下幾個(gè)方面看出：①沙利度胺能夠?qū)π律苌蛇M(jìn)行有效的抵抗；②沙利度胺能夠?qū)?xì)胞表面粘附因子進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)，同時(shí)對其相互間的作用有著深遠(yuǎn)的影響；③會對瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的多種細(xì)胞因子分泌造成極大程度的影響，將其生物活性改變；④在T和NK細(xì)胞上作用能夠促進(jìn)宿主免疫殺傷骨髓瘤細(xì)胞作用的顯著增強(qiáng)[4]。
2.1.2 沙利度胺衍生物 在MM的治療中，沙利度胺衍生物具有令人滿意的臨床療效，磷酸二酯酶抑制劑和非磷酸二酯酶抑制劑是其主要的分類，其中磷酸二酯酶抑制劑屬于選擇性細(xì)胞因子抑制劑，能夠?qū)δ[瘤壞死因子-A（TNF-A）進(jìn)行有效的抑制，不會激活T細(xì)胞；非磷酸二酯酶抑制劑屬于免疫調(diào)節(jié)藥物，能夠?qū)細(xì)胞顯著激活，對IL-2及INF-C進(jìn)行刺激[5]。免疫調(diào)節(jié)藥物來那度胺是美國Celgene公司研發(fā)出來的，對T細(xì)胞增殖能力進(jìn)行激活的能力及對IL-2及INF-C分泌的刺激能力均明顯比沙利度胺大。來那度胺還能夠?qū)M細(xì)胞的耐藥有效克服掉，從而對MM細(xì)胞的生長進(jìn)行有效的抑制。在其作用下，對美法侖及絲裂霉素等和地塞米松耐藥的受益患者分別達(dá)到了總數(shù)的20%~35%和50%[6]。此外，來那度胺還能夠促進(jìn)地塞米松抗MM作用的顯著增強(qiáng)。所有這些均告訴我們，在耐藥MM的治療中，來那度胺具有極為廣闊的應(yīng)用前景。
2.2 蛋白酶體抑制劑
硼替佐米屬于蛋白酶體抑制劑，是FDA在2003年批準(zhǔn)用藥，在復(fù)發(fā)性難治性MM的治療中具有良好的應(yīng)用效果，其能夠?qū)Φ鞍酌阁w26S亞基進(jìn)行特異性抑制，促進(jìn)I-JB降解的極大減少，并對NF-JB活性及IL-6觸發(fā)的MAPK生長信號進(jìn)行抑制，從而對MM細(xì)胞的增生進(jìn)行有效的抑制，組織MM細(xì)胞粘連骨髓基質(zhì)細(xì)胞( BMSC )，對其進(jìn)行誘導(dǎo)，使其凋亡，對NF-JB激活產(chǎn)生的耐藥性進(jìn)行有效的防止，同時(shí)切實(shí)有效地保護(hù)抗IL-6，對骨髓血管的新生造成阻礙，促進(jìn)DEX療效的顯著增強(qiáng)[7]。在初發(fā)MM的治療中，單藥硼替佐米達(dá)到了40%左右的緩解率，而硼替佐米+美法侖+潑尼松(VMP)、硼替佐米+ 沙利度胺+ 地塞米松(VTD)等聯(lián)合方案則能夠達(dá)到70%~90%的緩解率[8]。目前，臨床相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者正在通過實(shí)驗(yàn)對第二代蛋白酶體抑制劑進(jìn)行研究，預(yù)計(jì)其對腫瘤細(xì)胞的作用將明顯比硼替佐米高，而其不良反應(yīng)則將明顯比硼替佐米低。
2.3 免疫治療與分子生物學(xué)治療
在臨床腫瘤的治療過程中，大量應(yīng)用細(xì)胞因子的治療方法在重組基因工程技術(shù)中運(yùn)用細(xì)胞因子療法的情況下成為可能，而目前，在MM的治療中，白介素-2（IL-2）、IFN-C等是具有較為廣泛應(yīng)用的細(xì)胞因子。IFN-A屬于多功能細(xì)胞因子，能夠?qū)Σ《炯澳[瘤細(xì)胞增殖活性進(jìn)行有效的抵抗，同時(shí)還能夠?qū)θ梭w免疫功能進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)[9]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，如果MM患者伴有微小殘留病，那么IFN-A將會具有更為有效的治療效果[10]。近年來，在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，IFN-A已經(jīng)得到了日益廣泛的應(yīng)用，特別是在維持治療誘導(dǎo)緩解后或自體造血干細(xì)胞移植后的MM的治療中更是具有無比的優(yōu)越性。IL-2在宿主抗腫瘤免疫的細(xì)胞因子中占有極為重要的地位，在極大程度上調(diào)節(jié)著細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，能夠?qū)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行有效的刺激，對其進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞，顯著增加NK細(xì)胞的數(shù)目，對B細(xì)胞進(jìn)行刺激使其增殖分化，對T細(xì)胞進(jìn)行有效使其將IFN-A和IFN-C分泌出來，同時(shí)使移植物抗腫瘤效應(yīng)有效產(chǎn)生，將產(chǎn)生LAK細(xì)胞激活，在許多體內(nèi)、體外的腫瘤細(xì)胞中溶解，途徑為MHC非限制性方式[11-12]。
綜上所述，骨髓微環(huán)境在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，靶向治療中沙利度胺在補(bǔ)救治療初發(fā)骨髓瘤的過程中具有極為重要的作用，而ATO、VEGF受體抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等則在穩(wěn)定復(fù)發(fā)或難治MM患者的過程中具有極為重要的作用。目前，對患者進(jìn)行有效的分類，然后運(yùn)用有針對性的措施對患者進(jìn)行治療仍然是臨床需要關(guān)注的課題。廣大相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者應(yīng)該更進(jìn)一步深入細(xì)致地研究多發(fā)性骨髓瘤靶向治療等方法，以為減輕患者病痛、提升對患者治療的有效率及醫(yī)院的綜合效益做出積極的貢獻(xiàn)。
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（收稿日期：2014-04-29）
論文中醫(yī)學(xué)名詞術(shù)語的使用
1.冠以外國人名的體征、病名、試驗(yàn)、綜合征、方法、手術(shù)等，人名可以譯成漢語，但人名后不加“氏”字；也可以用外文，但人名后不加“′s”。例如：Babinski征，可以寫成巴賓斯基征，不寫成Babinski′s征，也不寫成巴賓斯基氏征。若為單字名則仍保留“氏”字。例如：福氏桿菌。
【關(guān)鍵詞】 HSG；結(jié)直腸癌；良性腺瘤；正常粘膜
增殖抑制基因 (hyperplasic suppress gene，HSG) 是陳光慧等[1，2]利用 mRNA差異顯示技術(shù)從正常血壓和高血壓大鼠的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新基因。前期的研究表明，高血壓動(dòng)物模型中HSG在增生活躍的血管平滑肌中呈低水平表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染外源性HSG可明顯地抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長，轉(zhuǎn)染外源性HSG對多種腫瘤傳代細(xì)胞系同樣也具有明顯的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用[3]。本文旨在觀察HSG在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)變化，初步探討HSG對結(jié)直腸癌演變的影響。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
收集唐山市工人醫(yī)院 2003 年 12 月～2005 年 12 月手術(shù)切除的直腸癌標(biāo)本 53 例，高分化癌 20 例，中分化癌 20 例，低分化癌 13例；其中男24 例，女29 例，年齡41 ～75 歲，平均年齡 56 歲；Ⅰ+Ⅱ期 20 例，Ⅲ+Ⅳ期 33 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性31例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性22例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或激素治療。以良性腺瘤標(biāo)本31例和正常人粘膜組織37例做對照。
1.2 主要試劑
兔抗人 HRG1 多克隆抗體由北京大學(xué)陳光慧教授饋贈(zèng)；免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
石蠟切片組織55℃烤4h后，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2 去除內(nèi)源性過氧化物酶，蛋白酶K 37℃ 消化10min，兔血清封閉非特異性抗原，加入HSG抗體，室溫過夜，生物素標(biāo)記二抗，酶標(biāo)三抗，室溫孵育各20min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染核，脫水，透明和封片。
1.4 結(jié)果判定
HSG以細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，且其著色強(qiáng)度顯著高于背景者判定為陽性。
HSG計(jì)量方法：蛋白表達(dá)的判定以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率的得分之和進(jìn)行評定。（a）染色強(qiáng)度：陰性為 0，弱陽性為 1，陽性為 2，強(qiáng)陽性為 3；（b）陽性細(xì)胞百分率：無陽性細(xì)胞為 0，＜25% 為1，26%～50%為2，＞50%為3，a+b之和最高為6，0～2判為陰性，3～6判為陽性。
應(yīng)用Image Pro plus數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測定細(xì)胞的平均光密度值和累計(jì)光密度值，計(jì)算測得值的平均值作為最終值。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS11.0軟件處理。樣本均數(shù)的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 HSG在結(jié)直腸不同組織中的表達(dá)
HSG 陽性染色主要集中于細(xì)胞核周圍，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞漿有少量表達(dá)，見圖1、2、3。在結(jié)直腸癌中，HSG蛋白表達(dá)的平均光密度值和累積光密度值明顯低于正常粘膜和良性腺瘤對照組（P＜0.05），而正常粘膜和良性腺瘤組的HSG值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。表1 HSG在結(jié)直腸不同組織中的光密度值 *P＜0.01，同良性腺瘤組比較；P＜0.01，同正常粘膜組比較
與正常粘膜和良性腺瘤組比較，結(jié)直腸癌組 HSG 表達(dá)率呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。表2 HSG在結(jié)直腸不同組織中的表達(dá) * χ2=4.389 P＜0.05 ，同良性腺瘤組比較；χ2=16.729 P＜0.01，同正常粘膜組比較
2.2 HSG與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
HSG在高、中、低分化癌組織中的表達(dá)分別為45.5% (9/20)、55.0% (11/20)、53.8%（7/13），χ2=0.458，P=0.795，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HSG在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組表達(dá)率38.7% (12/31) 顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組68.2% (15/22)，χ2=4.474，P=0.034；直腸癌Ⅲ+Ⅳ期中HSG陽性表達(dá)率為33.3% (11/33)，顯著低于Ⅰ+Ⅱ期中的80.0%(16/20)，χ2=4.74，P=0.029。
3 討論
增殖抑制基因（HSG）是陳光慧等利用mRNA差異顯示技術(shù)對SHR和WKY大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)cDNA文庫進(jìn)行篩選時(shí)分離得到的一個(gè)與VSMC增殖相關(guān)的新基因，因其在SHR和VSMC中表達(dá)活性降低而得名?；蛉L4.16kb，可編碼661個(gè)氨基酸，后來發(fā)現(xiàn)，該基因不僅在血管平滑肌內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在心、腎、腦、肺、肝、白細(xì)胞等不同組織中也有廣泛分布。有研究揭示，轉(zhuǎn)染hrg1蛋白能抑制Raf (Raf1)和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，下調(diào)抗細(xì)胞凋亡基因(bcl2)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)基因表達(dá)及抑制細(xì)胞增殖[4]。姜廣建[5]等發(fā)現(xiàn)HSG通過上調(diào)p27和下調(diào)cyclinE表達(dá)而發(fā)揮抑制VSMC增殖的作用。Santel等[6]發(fā)現(xiàn)，該基因可以控制線粒體的形態(tài)學(xué)變化，因而也與一些人類疾病相關(guān)，并在細(xì)胞信息的傳導(dǎo)中起著重要的作用。HSG定位于人的1p36.3位置，此區(qū)域?yàn)樵S多腫瘤的突變高發(fā)區(qū)，許多腫瘤患者染色體的這一區(qū)帶會出現(xiàn)缺失或易位。王萍[7]等研究發(fā)現(xiàn)HSG對多種腫瘤傳代細(xì)胞系具有明顯的增殖抑制作用，與放線菌酮(CHX)并用可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對 CHX的敏感性，具有協(xié)同作用，提示HSG有可能是新的抑癌基因。
目前，國內(nèi)外尚無對HSG在腫瘤發(fā)生發(fā)展中表達(dá)變化的相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用免疫組化法檢測結(jié)直腸癌、良性腺瘤和正常粘膜組織中的HSG表達(dá)，以期探討HSG是否具有抑制結(jié)直腸癌的惡性細(xì)胞增殖作用。結(jié)果表明：在結(jié)直腸癌組中，HSG蛋白的表達(dá)低于良性腺瘤組及正常粘膜組，而良性腺瘤與正常粘膜組表達(dá)無差異，提示HSG的表達(dá)可能在抑制細(xì)胞惡性增殖中及結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。這與李志新[8]觀察的外源性轉(zhuǎn)染大鼠HSG（rHSG）對腫瘤細(xì)胞具有明顯且廣泛的生長抑制作用結(jié)果相似。
HSG表達(dá)與腫瘤分化程度無關(guān)，而與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期密切相關(guān)，提示HSG有望作為判定腫瘤分化程度、病理分期的一種新的參考指標(biāo)。
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